22/02/20141projet atpase danini paul - fouan damien - perret thomas - renaudot raphael
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11/04/23 1Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael
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Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot
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IntroductionIntroduction
• Thèse de Thomas BalletThèse de Thomas Ballet
• Connaître la quantité de protéine Connaître la quantité de protéine renaturéerenaturée
• Démarche:Démarche:• Procéder par étape Procéder par étape • Courbe standard de chaque réactionCourbe standard de chaque réaction
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RéactionsRéactions
Enzyme + substrat + enzyme + produit
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Principe de la fluorescencePrincipe de la fluorescence
Valeur de Valeur de λλ Résorufine Résorufineλλmax absorptionmax absorption = 530 nm = 530 nmλλmax émission max émission = 585 nm = 585 nm
Choix des filtresChoix des filtresλλabsorptionabsorption = 540 nm = 540 nmλλ émission émission = 600 nm = 600 nm
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Renaudot Raphael 5
La solution tampon : élément La solution tampon : élément clé clé
• TRIS : 50 mMTRIS : 50 mM
• MgCl2 : 20 mMMgCl2 : 20 mM
• KCl : 150 mMKCl : 150 mM
• A pH = 7.2A pH = 7.2
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Première étape : gamme étalon de Première étape : gamme étalon de H2O2H2O2
AmplexRed + HAmplexRed + H22OO22 ResorufineResorufine
HRPHRP
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Renaudot Raphael 7
Première étape : gamme de HPremière étape : gamme de H22OO22
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Première étape : gamme de H2O2Première étape : gamme de H2O2
Puits 1 2 3 4
H202 (2 µM) 10 30 50 100
AR (50 µM) 10 10 10 10
HRP (0,3 U/ml) 20 20 20 20
Tris 160 140 120 70
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Première étape : gamme étalon de Première étape : gamme étalon de H2O2H2O2
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Influence du DTTInfluence du DTT
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Deuxième étape : gamme d’ADP Deuxième étape : gamme d’ADP globale globale
Enzyme + substrat + enzyme + produit
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Deuxième étape : essai de la réaction Deuxième étape : essai de la réaction globale globale
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Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase
Enzyme + substrat + enzyme + produit
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Renaudot Raphael 14
Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase
A B 1 2 3 4 5
Pox (µL) [à 15 U/mL] 2 10 15 20 30
Pyruvate (µL) [à 50 µM] 10 10 10 10 10
FAD (µL) [à 25 µM] 30 30 30 30 30
TPP (µL) [à 250 µM] 30 30 30 30 30
Phosphate (µL) [à 10 mM] 2 2 2 2 2
HRP (µL) [à 0.1 U/mL] 20 20 20 20 20
AR (µL) [à 50 µM] 10 10 10 10 10
Tris (µL) 96 88 83 78 68
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Troisième étape : gamme de pyruvate Troisième étape : gamme de pyruvate oxydaseoxydase
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Quatrième étape : gamme d’ADP Quatrième étape : gamme d’ADP globale globale
Enzyme + substrat + enzyme + produit
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Quatrième étape : gamme d’ADPQuatrième étape : gamme d’ADPF G 1 2 3 4 5 6 Blanc
ADP (µL)
10[à 10 µM]
50
[à 10 µM]80
[à 10 µM]10
[à 100 µM]50
[à 100 µM]80
[à 100 µM] 0FAD (µL) [à 250
µM] 3 3 3 3 3 3 3TPP (µL) [à 2.5
µM] 3 3 3 3 3 3 3PPP (µL) [à 250
µM] 2 2 2 2 2 2 2HRP (µL) [à 0.1
U/mL] 20 20 20 20 20 20 20kinase (µL) [à 50
U/mL] 45 45 45 45 45 45 45oxidase (µL)[à 15
U/mL] 30 30 30 30 30 30 30AR (µL) [à 50
µM] 10 10 10 10 10 10 10Phosphate (µL) [à 10
mM] 2 2 2 2 2 2 2Tris (µL) 75 35 5 75 35 5 85
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Quatrième étape : gamme d’ADPQuatrième étape : gamme d’ADP
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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase
Enzyme + substrat + enzyme + produit
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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase
A B 1 2 Blanc
P Kinase (µL) [à 238 U/mL] 9 90 0
ADP (µL) [à 100 µM] 10 10 10
PPP (µL) [à 250 µM] 20 20 20
Pox (µL) [à 15 U/mL] 30 30 30
Pyruvate (µL) [à 50 µM] 10 10 10
FAD (µL) [à 250 µM] 3 3 3
TPP (µL) [à 2.50 mM] 3 3 3
Phosphate (µL) [à 10 mM] 2 2 2
HRP (µL) [à 0.1 U/mL] 20 20 20
AR (µL) [à 50 µM] 10 10 10
Tris (µL) 83 2 92
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Dernière étape : gamme de pyruvate Dernière étape : gamme de pyruvate kinasekinase
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ConclusionConclusion
• Résultats prometteursRésultats prometteurs
• Utilisation du procédé:Utilisation du procédé:• Cinétique possible Cinétique possible • Mesure finale (?)Mesure finale (?)
• Solutions envisagéesSolutions envisagées• Kinase plus concentréeKinase plus concentrée
Merci de votre attention