TP 1 de génétique appliquée : Recombinaison mitotique

La recombinaison mitotique ne concerne que les cellules somatiques. Elle est proche de la recombinaison méiotique. Ce phénomène permet la création d’individus mosaïques.

Elle a lieu pendant la mitose, où des segments de chromosomes homologues peuvent accidentellement s’appareiller dans des cellules somatiques. Ceci est spécifique des diploïdes.

Chez un hétérozygote pour un gène donné, on va alors retrouver des cellules homozygotes pour ce gène. Ce phénomène extrêmement rare, qui est à notamment à l’origine de cancers, peut être induit.

Exemple chez la drosophile : Cellule somatique hétérozygote :

Y+ Y = mutant corps jaune ; Y+ = sauvage.

Y

Cette cellule va se multiplier. On a préalablement une phase de réplication. Puis on a ensuite mitose et séparation des chromatides sœurs. On retrouve ensuite 2 cellule filles génotypiquement identiques à la cellule mère.

Dans le cas de recombinaison mitotiques pendant la métaphase, on va avoir échange de chromatides : on se retrouve avec deux paires identiques de chromatides sœurs (avec une chromatide sauvage, et l’autre mutée). A la mitose, les chromatides se séparent et on va avoir apparition de cellules homozygotes.

Y Y

Y CO Y+Y+ Y

Y+ Y+

MITOSE

Y Y+Y Y+

Chez les cellules filles, la plus grande partie est hétérozygote. On trouve quelques cellules homozygotes issues de la recombinaison mitotique.

On va alors observer des colonies de clones sur un individu, ayant toute le même génotype, mais différent de celui de l’individu.

Ces Phénomènes sont rares mais on peut les induire, notamment par des rayons X ; Ceci nécessite un appareillage spécial. Le risque de mortalité est grand.

Pour pallier à ce problème de mortalité, il existe un système différent : le système FRT-FLP

FRT : Flipase regulation target : cible où la flipase va intervenir : lieu de recombinaison ; FLP : gène qui code pour la flipase.

Contrôle des recombinaisons mitotiques : en termes quantitatif, dépend de la localisation de FPL.

Expression de la FPL : on peut contrôler son expression en la plaçant derrière un promoteur inductible par un choc thermique. On peut aussi le placer derrière un promoteur d’orientation : elle ne sera exprimée que dans un tissu spécifique (par exemple le promoteur eyeless permet une expression exclusive dans les yeux.)

Grâce à cette expérience, on va obtenir des populations de clones cellulaires issus de recombinaison mitotique.

Analyse clonale somatique : SYSTEME FRT-FLP

flp

SitesFRT

Recombinaison site spécifique

+

+

m

m

+

+mm

m

+flp

Génotype:+ / m ; HS-FLP / +

P(actine)FRT FRT

Facteur de terminaison Gal4

Chromosome 2

Eyeless

Flipase

AUS

LacZ

Différence entre les cellules normales et les clones mitotiques : soit elles ont un phénotype particulier, soit on s’arrange pour pouvoir les marquer.

Premier croisement : 4410 x 5618On utilise le système GAL4 et le gène lacZ précédé par un promoteur de type AUS (induit par GAL4). Gal 4 est sur le chromosome qui contient les séquences FPS, et ne se verra transcrit que s’il y a recombinaison mitotique au niveau de ces séquences. S’il est transcrit, Gal4 ira activer la transcription de lacZ grâce au promoteur AUS, situé sur un autre chromosome.

Sur le chromosome 2, le promoteur de l’actine est un promoteur constitutif. La transcription a lieu continuellement. La transcription est cependant stoppée très rapidement au niveau du terminateur situé entre les deux séquences FRT. Dans les yeux, la flipase va s’exprimer, grâce au promoteur eyeless, et va agir au niveau des séquences FRT, situées sur le chromosome 2, en effectuant des crossing-over. La partie du génome situé entre les 2 FRT est alors remplacé par un fragment sans séquence terminatrice (fragment correspondant de l’autre chromosome 2). La transcription n’est alors pas stoppée et on va alors avoir transcription du gène Gal4. GalA va alors activer sur le chromosome le portant, la transcription du gène lacZ : on va alors avoir production de la βgalactosidase. On aura production de Bgal exclusivement dans les cellules où il y aura eu recombinaison mitotique, donc dans les cellules des yeux. Dans les autres cellules, la Bgal ne sera pas synthétisée.

Souche 4410 : Chromosome X : (w, P {ey-Gal4})Chromosome 2 : (P {UAS-lacZ) / Cyo (balanceur))

Souche 5618 : Chromosome X : (w, P {ey-FLP3})Chromosome 2 : +

CROISEMENT 1a:

Femelle 4410 : (w // w ; gal4, UAS-lacZ // CyO) x Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; + // +)

F1 : mâles : (w/Y ; gal4, UAS-LacZ // +) et (w / Y ; + // CyO)Femelles : (w/w, ey-FLP ; gal4, UAS-LacZ / +)* et (w/w, ey-FLP ; CyO/+)

CROISEMENT 1b :

Mâle 4410 : (w // Y ; gal4, UAS-lacZ // CyO) x femelle 5618 (w, ey-FLP // w, ey-FLP ; + // +)

F1 : mâles : (w, ey-FLP / Y, + // CyO) et (w, ey-FLP / Y ; gal 4, UAS-LacZ // +)*Femelles : (w // w, ey-FLP ; Gal4, UAS-lacZ // +)* et (w // w, ey-FLP ; + // CyO)

Seule * nous intéresse : on a le gène FLP, précédé par eyeless, qui permettra des recombinaisons mitotique seulement dans l’œil. On a le gène gal4 qui va pouvoir être transcrit grâce aux recombinaisons mitotiques, qui vont supprimer les terminateurs de transcription. Gal4 pourra induire la transcription du promoteur UAS, ce qui permettra la transcription de LacZ et donc de repérer l’emplacement des clones cellulaires concernée par la recombinaison mitotique, en ajoutant du Xgal.

44105618

On observe les larves issues de ces croisements. On va révélée la présence de recombinaisons mitotiques en révélant la présence de βgalactosidase, en « colorant » au Xgal.

Voici le protocole à suivre :

- On prélève 4 ou 5 larves mobiles puis on les place dans du PBS (un tampon).- On les coupe au niveau du deuxième tiers avec une lame de rasoir.- On pince l’extrémité coupée, puis on va effectuer un mouvement de retournement de la

larve (on fait passer l’extérieur à l’intérieur) en appuyant avec une aiguille depuis la tête vers l’extrémité coupée. La larve est retournée sur l’aiguille. On la remet dans le PBS.

- Une fois les larves retournées, on évacue le PBS, puis on met du fixateur (glutaraldéhyde) pour figer les structures.

- On rince ensuite 2 fois au PBS, pour évacuer le fixateur- On réalise ensuite une pré-coloration, qui consiste à imbiber les larves avec la solution de

colorant- On colore ensuite avec une solution contenant un tampon et du Xgal. Le Xgal est métabolisé

par la βgalactosidase ce qui donne un composé bleu.

On constate une coloration au niveau des disques imaginaux des yeux. Seulement les yeux sont colorés car on a orienté les recombinaisons dans l’œil grâce au promoteur eyeless : FLP est activée, la recombinaison entre les deux FRT a lieu, ce qui permet la transcription de Gal4. Gal4 va induire la transcription de LacZ.

Remarque : on utilise un balanceur pour inhiber les recombinaisons (méiotiques) au niveau du chromosome portant la mutation, pour éviter de retrouver des individus homozygotes : on est sûr de conserver des individus hétérozygotes. A revoir

Deuxième croisement : 5618 x 2296Souche 5618 : Chromosome X : w, P (ey-FLP)

Chromosome 2 : P(FRT en 80B)Souche 2296 : Chromosome X : w

Chromosome 2 : P(white) 70C (= mini white w+), P{FRT}80B / Tm6 (Balanceur)

Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; FRT80 / FRT80) x femelle 2296 (w / w ; w+, FRT80 / Tm6)[œil blanc] [œil rouge]

F1 : Mâles : (w / Y ; FRT80 / TM) et (w / Y ; FRT80 / FRT80, w+) [œil blanc] [œil rouge]

Femelle : (w / eyFLP ; FRT80 / TM) et (w / w, eyFLT ; w+, FRT80 / FRT80) [œil blanc] [œil rouge]*

FRT w+ Après recombinaison voici le génotype de la cellule de l’œil. Chaque chromosome s’est

Chr 2 répliqué, on a alors 2 chromatides FRT appareillées avec w+ et é autres sans w+.

Chr 2 La cellules exprime la flippase.

Pendant la mitose, les centromères se retrouvent sur la plaque équatoriale et chaque chromatides ira dans l’une ou l’autre des cellules. On aura donc formation de cellules filles hétérozygotes comme la cellule mère.

Dans le cas de CO mitotique, on va avoir un échange au niveau des séquences FRT, entre les chromatides sœurs. Ceci conduit alors à des chromatides sœurs différentes.

FRT w+

FRT w+

Lors de l’anaphase, on aura alors 1 chance sur 2 d’avoir formation de 2 cellules filles différentes et homozygotes : une sera w+ et l’autre ne portera pas l’allèle w+. On a alors, dans le cas de CO mitotiques, formation d’une cellule rouge (qui ne redonnera que des rouges par la suite) et d’une cellule blanche (qui en redonnera que des blanches par la suite) après la mitose. On s’attend à trouver la moitié de cellules rouge et la moitié de cellules blanches. La séparation des chromatides à l’anaphase peut redonner des hétérozygotes mais lors de la mitose suivante on pourra encore avoir un CO : les hétérozygotes sont ainsi contre sélectionner car quand une cellule homozygote est formée, il pourra y avoir des CO mais ceci ne changera pas le phénotype couleur.

Observation des mouches : Quand on observe les yeux des drosophiles femelles, on constate alors que l’œil est principalement rouge, mais que certaines zones (notamment sur les bords) sont blanches. Le résultat n’est pas celui attendu, les clones blancs semblent contre sélectionnés.

Croisement 3 : 5621 x 1988On veut ici contre-sélectionner les clones rouges issus de la recombinaison mitotique. On associe à l’allèle w+, un allèle létal à l’état homozygote. Lors d’un CO mitotique, on aura alors formation d’homozygote sans w+ et d’homozygote w+/w+. w+ étant associé de très près au gène létal, il n’y aura pas de clone rouge visible, les cellules mourant. Le gène létal est le gène rps.

Les seuls qui nous intéressent sont marqués d’un point rouge. Il présente le promoteur eyeless qui permet l’expression dans les yeux, le gène white à l’état homozygote qui va donc s’exprimer, frt80 à l’état homozygote qui permet la recombinaison par la flipase. Il contient aussi le gène rps, associé à w+ (miniwhite). Les clones cellulaires issus de la recombinaison mitotique ayant l’allèle rps homozygote et donc de phénotype [rouge] (car homozygote W) moment. On ne les observera donc pas, au profit des clones mitotiques [blancs].

F1

Les promoteurs HS (Heat Choc)Ce sont les promoteurs des gènes codant pour des protéines impliquées dans une réponse cellulaire de défense contre stress (augmentation de température, manque d’oxygène. Ces protéines sont nommées HSP (heat choc protéin) et vont engendrer des phénomènes visant à préservée la cellule en cas de stress important, pour permettre une survie (dans la limite du possible). Elles vont, par exemple, stabiliser les complexes protéiques comme les microfilaments pour éviter une désorganisation de la structure cellulaire. Ce sont des facteurs de transcriptions, les HSF, dont le taux augmente lors d’un stress, qui ciblent les régions régulatrices des promoteurs des protéines HSP. Ils permettent alors l’expression des gènes sous contrôle de ce type de promoteur.

Cellule somatique des disques imaginaux qui donneront les yeux

Recombinaisons mitotiques possibles grâce aux 2 séquences frt et à la flp qui s’exprime

Meurt car homozygote rps

[rouge]

On contre-sélectionne les individus obtenus après recombinaison mitotique, homozygotes pour rps et présentant un phénotype rouge

[blanc]

On retrouve les génotypes parentaux

HRE Gène HSP

Promoteur HSP : contient HRE (Heat Response element) sur lequel se fixe HSF

HSF

Protéine HSP

ADN

HRE Gène Flippase

Promoteur HSP : HSF va s’y fixer dans le cas d’un choc thermique, ce qui va activer le promoteur et permettre la transcription du gène de la flippase

HSF

Protéine HSP

ADN

Ici on détourne ce système de promoteur pour induire l’expression d’un gène rapporteur : le gène de la Flippase, flp. On place le promoteur juste devant le gène de la flippase. Pour induire la synthèse de la flippase, on va augmenter la température, ce qui va alors activer les HSF.

Avec FLP activée, on augmente événements de recombinaisons mitotiques.

On dispose de différentes souches de drosophiles. La souche 1740 contient, sur X, le gène sn et Frt 19 (zone de recombinaisons induites par la flippase). L’allèle sn, est responsable, si celui-ci est à l’état homozygote, d’un phénotype particulier [soie frisée, courte et épaisse]. La souche 5132 contient, sur X, Frt 19 et HsFlp (configuration décrite ci-dessus).

Croisements

On incube les larves à une température qui déclenche l’activation des promoteurs HSP (37°C). Les recombinaisons mitotiques pourront alors se faire pendant le développement larvaire (larve stade 3)

et on aura la possibilité de voir apparaitre des soies frisées partout sur la drosophile adulte. Ici ce sont sur les cellules somatiques en multiplication au niveau de la F1 que se font les recombinaisons et pas au niveau des cellules germinales chez les parents. C’est le stade 3 qui est choisi, car on se situe avant la différentiation des soies.

Questions :

Quels sont les génotypes respectifs

Quelle descendance peut-on en déduire ? Et quels sont les descendants qui présenteront un phénotype mosaïque.

Dessins aurélien

Après avoir décrits les phénotypes attendus, on va étudier le phénotype de drosophiles ayant été exposées plus ou moins longtemps à 37°C, pendant leur stade larvaire. On observe des drosophiles, de 6 tubes différents, issues de ce croisement. Les tubes A, B, C, D, F et E contiennent respectivement des drosophiles dont les larves, au stade 3, ont été exposées 5, 10, 20, 30, 45 et 60 minutes.

On va dans un premier temps, compter le nombre d’individu possédant un phénotype mosaïque, en fonction du tube. On va pouvoir apprécier l’action de la durée d’exposition sur le nombre d’individu mosaïque. On regroupe les résultats des deux groupes de TP dans le tableau suivant.

Pourcentage de femelles mosaïquesGroupe 1 Groupe 2

E 72,7 69,00F 45,5 60D 43,9 55C 31,3 21B 17 8A Pas de comptage 3

Le comptage des témoins semble avoir été omis pour les deux groupes. Cependant, ceux n’ayant pas été exposé au choc thermique, il n’y a aucune raison pour que la flippase ait été synthétisée et que des recombinaisons mitotiques aient eu lieu. On devrait donc observer 0 individu mosaïque. On ne peut cependant pas exclure le fait de trouver un pourcentage infime d’individu mosaïque dans ce pool de drosophile, car une des larves aurait pu être confrontée à un stress d’une origine indépendante de la volonté du manipulateur.

On constate premièrement que selon le groupe de TP, on ne trouve pas les mêmes résultats. Il y a donc une variation en fonction de l’expérimentateur, qui vient surement du manque d’attention de certains manipulateurs qui bâcleraient le travail. Il est vrai qu’observer une drosophile sous toutes ses coutures pour déterminer si c’est un individu mosaïque peut s’avérer être un exercice fastidieux.

Le constat de ce comptage est que le nombre d’individu mosaïque augmente avec la durée d’exposition à 37°C. En théorie, si on exposait suffisamment longtemps les larves, on aurait 100% des individus qui seraient mosaïques. Le fait que certains le soient, et d’autre non, vient du fait que la réponse individuelle au choc thermique de chacune des larves est différente. Les drosophiles, qui au

bout de 5 minutes d’exposition, ont un phénotype mosaïque déclenchent très rapidement la synthèse de HSF. Par contre celles qui ne sont pas mosaïque au bout d’une heure d’exposition nécessitent d’avoir plus de temps pour déclenché cette synthèse et donc l’activation du promoteur HS. On comprend alors que, plus le temps d’exposition est important, plus la quantité d’individus mosaïque sera grande.

Dans un second temps, on va s’intéresser au nombre de soies frisées sur un individu mosaïque. En effet c’est également un moyen d’estimer l’action de la durée d’exposition sur le phénotype mosaïque, donc sur les recombinaisons mitotiques et l’activité du promoteur HS. On s’intéresse aux individus de deux tubes, les tubes E et D, exposés respectivement 60 et 30 minutes.

Nombre de soies

nombre de mouche

E (60 min)

16 713 614 66 3

61 925 629 6

D (30 min)

9 511 511 56 3

On peut calculer les moyennes : Pour E, on a donc 164 soies frisées pour 43 mouches, ce qui fait 3,81 soies par mouches. Pour D, on a 37 soies pour 18 mouches, ce qui fait 2,05 soies frisées par mouche. On constate bien que le nombre de recombinaisons mitotique augmentent en fonction du temps croissant d’exposition des larves à 37°C. Cependant ces résultats sont moins appréciables que ceux obtenus pour le comptage des mouches mosaïques, ils sont plus durs à interpréter : ici on met plutôt en évidence des variations entre les cellules d’un même individu et non les différences entre deux individus.

Il n’y aura jamais des individus 100% mosaïque : le maximum est d’un quart. En effet, si on regarde le schéma de mitose présentée précédemment dans ce contexte, statistiquement, seulement ¼ des cellules filles sont homozygotes pour sn, donc présentant ce phénotype, dans le cas d’une recombinaison mitotique au niveau de la cellule qui donnera l’ensemble des cellules impliquées.