13.analyses microbiologiques

Chapitre III Diagnostic et évaluation

4. établissement des procédures de vérification :

La vérification de la méthode HACCP est une activité mise en œuvre pour s’assurer que ce

système fonctionne efficacement.

4.1. Les analyses microbiologiques :

Les produits alimentaires peuvent contenir une flore microbienne plus au moins abondante qui

peut être nuisible pour leur qualité, et pour la santé du consommateur. Des micro-organismes

sont utilisés comme des agents technologiques et leur présence est parfois indispensable pour

certaines industries alimentaires.

L’analyse bactériologique des produits alimentaires est indispensable pour :

Assurer au produit une bonne qualité et une longue conservation.

Garantir la qualité hygiénique du produit.

4.1.1. La matière première :

a) L’eau de reconstitution :

1) Technique de prélèvement et d’échantillonnage :

Le prélèvement s’effectue directement par le robinet de tank de lancement, ceci après avoir

flambé l’orifice du robinet probablement désinfecté, on laisse couler un moment et à l’aide d’un

flacon stérile, on prélève 250 ml.

2) Dilution :

On travail avec la solution mère qui représente le prélèvement de 250 ml de l’eau de

reconstitution.

3) Recherche microbiologique :

L’eau constitue un élément essentiel dans l’industrie laitière les micro-organismes rencontré dans

l’eau sont très variés, leur nature dépend de celle de l’eau à analysée.

Les germes recherchés dans l’eau de reconstitution sont :

Recherche et dénombrement des Germes Totaux.

Recherche et dénombrement des germes de contamination fécale (Coliforme Totaux et

Fécaux)


Recherche et dénombrement des Entérocoques (Streptocoques Fécaux).

Recherche et dénombrement des Clostridies Sulfito-Reducteurs.

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Totaux : schéma n° 01

Leur dénombrement nous renseigne sur la charge microbienne du produit, et il chiffre le degré de

contamination.

La technique utilisée est celle de numération en milieu solide (P.C.A ou T.G.E.A) en boites de

petries avec ensemencement dans la masse.

Méthodologie :

La technique consiste à introduire aseptiquement 1 ml de la solution mère dans chaque boites de

petries (02 boites), couler par la suite environ 20 ml de la gélose P.C.A. Faire des mouvements

circulaires pour bien mélanger et laisser les boites solidifier sur la paillasse.

Incubation :

- La 1ère boite sera incubée à 37°C pendant 24 heures.

- La 2eme boite sera incubée à 22°C pendant 72 heures.

Lecture :

Les colonies de germes totaux se présentent sous forme lenticulaire en masse.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte du facteur

suivant :

- Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.


1 ml 1 ml

- Ajouter 20 ml de gélose PCA ou TGEA- Laisser solidifier sur paillasse- Incuber pendant :

22°C (72 heures) 37°C (24 heures)

- Dénombrer les colonies lenticulaires en masse.

Eau à analysée

Schéma n° 01 : recherche des Germes Totaux dans l’eau.


3.2) Recherche et dénombrement des contaminations fécales (Coliformes Totaux et Fécaux) : schéma n° 02

La méthode adapter pour cette analyse est la technique du dénombrement en tube multiple

(NPP). (Annexe

Le milieu utilise est le BCPL (Bouillon Lactose au Pourpre Bromocréol).

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

Le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes.

Le test de confirmation : (test Mac Kenzie) réservé à la recherche des Coliformes Fécaux

(à partir des tubes positifs du test de présomption).

Test de présomption :

Porter aseptiquement de l’échantillon d’eau à analysée :

- 50 ml dans un flacon contenant 50 ml du milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de

durham.

- 5 fois 10 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de

durham.

- 5 fois 1 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (S/C) muni d’une cloche de

durham.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :

Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche.

Un trouble microbien accompagné d’un virage de couleur du milieu au jaune (ce qui

constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu).

Les résultats sont négatifs si les tubes et flacon ne présentent aucun trouble et aucun

dégagement gazeux.

La lecture se fait selon la prescription de la table de Mac Grady (Annexe

Test de confirmation au test de Mac Kenzie :


Les tubes de BCPL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes Totaux, ferrant l’objet

d’un repiquage dans le milieu de BCPL muni d’une cloche de durham et EPEI (Eau Peptone

exemple d’Indol).

Incubation :

L’incubation se fait à 44°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :

Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche).

Un anneau rouge en surface témoin de la production d’indol par l’Echérichiacoli après

adjonction de 02 à 03 gouttes de réactif de Kowacs.

La lecture finale se fait selon la prescription de la table de (NPP) en tenant compte du fait

qu’Echérichiacoli est à la fois producteur de gaz et d’indol à 44°C.

10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml


250ml Eau a analysée

Test de présomption

10 ml 1 ml

BCPL (D/C) +

Cloche durham BCPL (D/C) BCPL (S/C)

Incubation à 37°C pendant 24 H

Réaction négative

BCPL EPEI

3.3) Recherche et dénombrement des Clostridium Sulfito-Réducteurs : schéma n°03

50 ml

1O mlTrouble microbien +

Gaz dans la cloche

Réaction positive

Test de confirmation

Anneau rougeIncubation à 44°C pendant 24 H

+2 gouttes du kowacs

Schéma n°02 : Recherche des Coliformes (Totaux et Fécaux) dans l’eau.


Les Clostridium sulfito-Réducteurs sont des germes anaérobies qui ont le pouvoir de réduire le

sulfite en sulfure, et capables de former des spores dans les conditions défavorables.

Méthodologie :

Prendre 05 tubes vides et stériles, mettre 5ml d’eau à analysée dans chacun des 04 tubes et 1ml

d’eau à analysée dans le 5ème tube.

Puis, porter les tubes au bain marie à 80°C pendant 10mn, et après refroidir immédiatement ces

tubes sous jet d’eau froide.

Ensuite, ajouter environ 20ml de gélose VF (viande foie) (après avoir ajouté à cette dernière une

ampoule de 5ml de sulfite de sodium et une ampoule de 1ml de l’alun de fer) dans chaque tubes.

Incubation :

Incuber les 05 tubes à 46°C pendant 48 heures.

Lecture :

La 1ere lecture se fait impérativement après 16 heures d’incubation.

Dans le cas où il n’y pas de colonies noires, réincuber les tubes et effectuer une 2 ème lecture après

24 heures voir 48 heures.

Dénombrement :

On compte les colonies noires directement dans les tubes positifs.

On note : - Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 20 ml. (Somme des résultats des

04 tubes)

- Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 1 ml.

Eau à analysée

Ajouter environ 20 ml de gélose VF (+02 ampoules contenant :5 ml de sulfite de sodium, 1 ml de l’alun de fer)Puis incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures.

La lecture se fera sur 1 mlLa lecture se fera sur 20 ml la somme des 04 tubes

Chauffage à 80°C, 10 minutesRefroidissement brutal sous l’eau de robinet


5 ml 5 ml 5 ml 5ml 1ml

Schéma n° 03 : Recherche des Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans l’eau de reconstitution


b) La poudre de lait écrémé et entier :


Le lieu de prélèvement est le laboratoire des analyses microbiologiques, 03 échantillons sont

prélevés à partir de 03 sacs de 25kg de poudre de lait à 0%, et à 26% de matière grasse, cette

poudre est conditionnée dans des sacs en polyéthylènes et doublés en papier hermétiquement

fermé. La surface des sacs a été nettoyée et désinfectée par l’alcool et la couche supérieure a été

écartée à l’aide d’une spatule stérile. On procède à un échantillonnage à l’aide d’une sonde

métallique stérile à proximité de la flamme.

2) Dilutions :

Introduire aseptiquement 25 g de poudre dans un flacon stérile contenant 225ml de TSE puis

homogénéisé l’ensemble a fin d’obtenir la solution mère.

A partir de cette dernière, on prélève 1ml à l’aide d’une pipette stérile et on le porte dans un tube

contenant 9ml d’eau physiologique, c’est la dilution 10-1. On prend 1ml de la dilution 10-1 à

l’aide d’une autre pipette et on le porte dans un autre tube contenant 9 ml d’eau physiologique ce

qui nous donne la dilution 10-2. La même technique est répète pour obtenir la dilution 10-3.


Les germes recherchés dans la poudre de lait sont :

- La Flore Mésophile Aérobie Total (F.M.A.T)

- Les Coliformes Totaux.

- Les Clostridiums Sulfito-Réducteurs.

- Les levures et moisissures.

- Les Salmonella.


3.1) Recherche et dénombrement de la Flore Aérobie Mésophile Total

(F.M.A.T) : (schéma n°04)

Méthodologie :

A partir des dilutions décimales allant de 10-1, 10-2, 10-3, porter aseptiquement 1ml de

l’échantillon dans 03 boites de petries vides et stériles préparées à cet usage.

Compléter ensuite avec environ 20 ml de gélose P.C.A fondue, puis faire des mouvements

circulaires pour permettre à l’inoculum de ce mélangé à la gélose utilisée.

Laisser les boites solidifier sur paillasse quelques minutes.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 30°C pendant 72 heures.

Lecture :

Les colonies de F.M.A.T se présentent sous forme de lenticulaire en masse.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs

suivants :

Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.

Multiplier le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution.

Faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.


10-1 10-310-2

A partir des dilutions décimales

1 ml 1 ml 1 ml

- Ajouter 20ml de gélose PCA- Laisser solidifier sur paillasse- Incuber à 30°C pendant 72 heures

- Puis dénombrement les colonies lenticulaires en masse

Schéma n° 04 : Recherche des Germes Aérobies Mésophiles Totaux dans la poudre de lait.


3.2) Recherche et dénombrement des coliformes totaux : schéma n°05

Méthodologie :

Préparer 03 dilutions 10-1, 10-2, 10-3, prendre 03 boites de petries vides et stériles et mettre dans

chacune 1 ml de l’échantillon.

Couler ensuite, environ 20 ml de la gélose Désoxycholate fondue dans un chaque boites puis

faire des mouvements circulaires pour obtenir un mélange homogène. Laisser les boites solidifier

sur paillasse quelques minutes.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les Coliformes Totaux se présentent sous forme de colonies rouge foncées).

- Le dénombrement des boites se fait par le comptage des colonies (rouges foncés). Le nombre

trouvé sera multiplié par l’inverse de la dilution de chaque boite de petries, puis faire la

moyenne arithmétique des 03 boites.



10-1

10-310-2

C.Totaux C.TotauxC.Totaux

- Ajouter 20 ml de la gélose Désoxycholate.- Laisser solidifier quelques minutes.- Incuber à 37°C pendant 24 heures.

- Dénombrer les colonies rouge foncées.

1 ml 1 ml1 ml

Schéma n° 05 : Recherche des Coliformes Totaux dans la poudre.


3.3) Recherche et dénombrement des Clostridiums Sulfito-Réducteurs : schéma n°06

Méthodologie :

Faire subir aux tubes des dilutions 10-1, 10-2, un chauffage de 80°C pendant 1O mn et un

refroidissement immédiat sous jet d’eau.

Puis a partir de ces tubes portes aseptiquement 1 ml d’échantillon dans 02 tubes à essai contenant

environ 20 ml du milieu VF (+ 1ampoule de l’alun de fer et une ampoule de sulfite de sodium) et

bien mélanger.

Incubation :

Ces tubes seront ainsi incubés à 46°C pendant 16, 24, ou au plus tard 48 heures.

Lecture :

La première lecture doit se faire impérativement à 16 heures d’incubation, car :

D’une part, les colonies de Clostridium sont envahissantes dans ce cas on ce trouverait en

face d’un tube complètement noir rendant alors l’interprétation des résultats impossible.

D’autre part, il faut absolument repérer toute colonie noir ayant poussé en masse et d’un

diamètre supérieur à 0,5 mm.

Dans les cas d’absence de colonies caractéristiques, ré incuber les tubes une deuxième fois et

effectuer une lecture au bout de 24 heures voir 48 heures.

Le nombre de colonies trouvées doit être multiplié par l’inverse de la dilution.

10-1 10-2

Chauffage à 80°C pendant 10mn.Refroidissement immédiat sous jet d’eau

1 ml 1 ml

Ajouter environ 20 ml de gélose VF (+02 ampoules : alun de fer et sulfite de sodium).Laisser solidifier puis incuber à 40 pendant 16-24 ou au plus tard 48 heures

Dénombrement des colonies en masse.


Schéma n° 06 : Recherche des Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans la poudre de lait.


3.4) Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures : schéma n°07

Les levures et moisissures sont des germes aérobies, leur dénombrement se fait sur milieu de

Sabouraud.

Méthodologie :

On porte aseptiquement 1 ml à partir des dilutions allant de 10-1, 10-2, 10-3, dans 03 boites de

petries vides et stériles.

Verser ensuite, environ 20 ml de gélose de Sabouraud fondue, faire des mouvements circulaires

afin d’homogénéiser le mélange, puis laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Elle se fait à 20 – 25°C pendant 3 à 5 jours avec couvercles en haut.

Lecture :

Après incubation, on effectue le comptage des Levures à part (grandes colonies rondes) et des

Moisissures (des colonies ramifiées) d’autre part.

Multiplier ensuite le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, puis faire la somme des 03 boites

et calculer la moyenne arithmétique pour avoir le nombre exact des Levures et Moisissures.

10-1 10-310-2

1 ml 1 ml 1 ml

Ajouter 20 ml de gélose Sabouraud.Laisser solidifier sur paillasse.Incuber à 20 – 25°C. pendant 3 à 5 jours (couvercle en haut).

Dénombrement les Levures à part et des Moisissures d’autre part


Schéma n° 07 : Recherche des Levures et Moisissures dans la poudre de lait.


3.5) Recherche et dénombrement des Salmonella : schéma n°08

La recherche du genre Salmonella nécessite une prise d’essai a part :

Jour 1 : pré-enrichissement :

Prélever 25g de la poudre de lait et la porter dans un flacon de 225 ml de T.S.E, incuber à 37°C

pendant 12 – 18 heures.

Jour 2 : Enrichissement :

L’enrichissement doit s’effectuer sur un milieu sélectif : S.F.B (bouillon au sélénite cystéine)

(S/C) repartie à raison de 100ml par flacon auquel on ajoute 2 ml d’additif « sélénite acide de

sodium ».

Prendre 10 ml à partir du milieu de pré-enrichissement et les mettre dans le flacon de S.F.B puis

incuber à 37°C pendant 24 heures.

Jour 3 : Isolement :

Le flacon de sélénite positif (couleur rose) fera l’objet d’un isolement en stries sur le milieu

gélose Hectoen, préalablement couler en boites de petries a raison de 15ml à 18ml et sécher en

en les plaçant couvercles en bas dans un étuve de séchage entre 45 et 55°C.

Incubation :

Incuber à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les colonies de Salmonella sont présentent le plus souvent en gris bleu à centre noir.

T.S.E225ml

SFB S/C 100ml

Gélose Hectoen

Dénombrement les colonies grises bleues à centre noir

Incubation 37°C pendant 24 heures

Incubation 37°C pendant 24 heures

Homogénéisation et incubation 37°C pendant 12 – 18 heures

25 g du produit à analyserPré-enrichissement

EnrichissementAdditif : sélénite acide de sodium (2ml)

Isolement

10ml


Schéma n° 08 : Recherche des Salmonella dans la poudre de lait.


4.1.2. Lait après pasteurisation


La prise d’échantillon est réalisée au niveau de robinet du tank de repos. Après stérilisation du

robinet par flambage, on laisse couler le lait quelques secondes (30 secondes) puis à l’aide d’un

tube à essai, on prélève le liquide jusqu’à remplissage du tube.

2) Dilution :

On transfère à l’aide d’une pipette pasteur stérile, 1 ml de la suspension mère dans un tube qui

contient 9 ml d’eau physiologique et on agite bien, pour obtenir la dilution 10 -1. De ce dernier on

va porter 1 ml par une autre pipette graduée dans un autre tube stérile contenant 9 ml d’eau

physiologique ou on obtient la dilution 10-2. De la même façon, on obtient la dilution 10-3.


Les germes recherches sont :

- Recherche et dénombrement des Germes Totaux.

- Recherche et dénombrement des germes de contamination fécal (Coliformes Totaux et

Fécaux)

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Totaux : schéma n°09

La numération des germes totaux se fait sur le milieu solide (P.C.A).

Méthodologie :

On porte aseptiquement 1ml de l’échantillon à partir des dilutions décimales allant de 10 -1, 10-2,

10-3, dans 03 boites de petries vides et stériles.

Couler ensuite environ 20 ml de la gélose P.C.A fondue, puis faire des mouvements circulaires

pour permettre de bien mélanger puis laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 30°C pendant 72°C.

Les colonies des Germes Totaux se présentent sous forme lenticulaire en masse.

- Premier lecture à 24 heures.


- Deuxième lecture à 48 heures.

- Troisième lecture à 72 heures.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant des facteurs

suivants :

Ne dénombrement que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.

Multiplier le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution.

Faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.


10-1 10-2 10-3

1 ml 1 ml 1 ml

Ajouter 20ml de la gélose P.C.A.Laisser solidifier sur paillasse.Incuber couvercles en bas à 30°C pendant 24 – 48 à plus tard 72 heures

Dénombrer les colonies lenticulaires en masse.


Schéma n°09 : Recherche des Germes Totaux dans le lait pasteurisé.


3.2) Recherche et dénombrement des germes de contamination fécal

(Coliformes Totaux et Fécaux) : schéma n°10

Les Coliformes sont dénombrés sur le milieu solide Désoxycholate.

Méthodologie :

Après la préparation des dilutions décimales 10-1, 10-2, 10-3, on porte aseptiquement 1 ml

d’échantillon dans 03 boites de perties vides et stériles.

Cette opération doit être effectuée en double pour chaque dilution :

Verser ensuit 20 ml de la gélose Désoxycholate fondue, puis faire des mouvements

circulaires, pour bien mélanger la gélose à l’inoculum.

Laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Les boites seront donc incubées couvercle en bas pendant 24 à 48 heures :

37°C pour la première série (recherche des Coliformes Totaux).

44°C pour la deuxième série (recherche des Coliformes Fécaux).

Lecture :

Les Coliformes (Totaux et Fécaux) apparaissant sous forme de colonies de couleur

rouge foncé fluorescentes.

Le nombre trouvé est multiplié par l’inverse de la dilution puis on fait la somme des 03

boites de petries et ensuite calculer la moyenne arithmétique cela nous donne le nombre

final des germes.


10-1 10-2 10-3

C.Totaux

C.Fécaux

C.Totaux C.Totaux

Ajouter 20 ml de gélose de DésoxycholatePremière série de boites à incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures.

C.FécauxC.Fécaux

Ajouter 20 ml de gélose de DésoxycholateDeuxième série de boites à incuber à 44°C pendant 24 à 48 heures.

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml


Schéma n° 10 : Recherche des germes de contamination fécal (Coliformes Totaux et fécaux) dans le lait pasteurisé.


4.1.3. Le produit fini (lait UHT) :


Le lait UHT est prélevé dés sa sortie de la conditionneuse chaque 02 heures, 1 fardeau contenant 4 briques est retiré :

1 brique analysée le jour même. 1 brique incubée à 55°C pendant 7 jours. 1 brique incubée à 30°C pendant 15 jours. 1 brique incubée à température ambiante pendant 03 mois. Sachant qu’on a suivi dans nos prélèvements, la réglementation du journal officiel de la

république Algérienne du 23 Mai 2004.2) Dilution :

On n’a pas besoin de dilution pour l’ensemencement du produit fini, car on travail avec la

suspension mère qui est le produit conditionné.

3) Recherche micro biologique :

Le contrôle microbiologique du lait UHT est déterminé par les critères suivants :

1- Recherche et dénombrement des Germes Aérobies.

2- Test d’alcool.

3- Test de chaleur.

4- Test de stabilité.

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Aérobies : schéma n°11

Le taux de présence de cette flore indique la bonne ou la mauvaise qualité microbiologique et la

stabilité du lait.

La technique utilisée est celle de la numération en milieu solide PCA en boite de petrie avec

ensemencement en masse.

Méthodologie :

A l’aide d’une pipette graduée, en introduit en aseptiquement 1ml du lait UHT conditionné dans

une boite de petrie stérile, puis couler environ 20ml de la gélose PCA en surfusion, faire des

mouvements en rotations pour bien mélangé l’inoculum et laisser la boite se solidifiée sur la

paillasse.

Incubation :

Incubée la boite couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures.

Lecture :

Réalisé le dénombrement des colonies présentent dans la boite sous forme lenticulaire en masse.

1 ml (Lait UHT)

Ajouter 20 ml de gélose PCA en surfusion.Laisser solidifier sur la paillasse.Incubation couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures.

Dénombrer les colonies sous formes lenticulaires en masse.


Schéma n°11 : Recherche des Germes Aérobies dans le produit fini.


3.2) Le test d’alcool :

Méthodologie :

Mélanger 2 ml d’une solution aqueuse Ethanol à 2 ml de lait UHT dans un tube à essai stérile,

agiter bien le mélange pendant quelques secondes.

Lecture :

- S’il y a une floculation, les résultats sont positifs.

- S’il n’y a pas de floculation, on considère les résultats comme négatifs.

3.3) Test d’ébullition :

Méthodologie :

Introduire dans un tube à essai 2 ml de lait UHT, et porter le tube dans un bain-marie à 100°C

pendant une demi-heure.

Lecture :

- Résultat positif si le lait coagule.

- Résultat négatif si le lait ne coagule pas.

3.4) Test de stabilité :

L’épreuve de stabilité comporte les opérations suivantes :

- Etuver, pendant 15 jours une unité d’échantillonnage à une température de 30°C.

- Etuver pendant 7 jours une unité d’échantillonnage à une température de 55°C. Le lait

UHT doit rester stable après incubation.


4.2. Les analyses physico-chimiques :

Le contrôle physico-chimique à pour but d’analyse les matières premières, lait reconstitué et

pasteurisé et le produit fini (lait UHT) en passant par les différents paramètres.

Il présente l’avantage de signaler toutes erreurs de fabrication, et modification des paramètres de

processus de fabrication.

4.2.1. Eau de reconstitution :

a) Détermination de l’alcalimétrie de l’eau :

Cette détermination et basée sur la neutralisation d’un certain volume d’eau par un acide minéral,

dilué, en présence d’un indicateur coloré.

a.1) Titre alcalimétrique simple : (T.A) :

Principe :

Addition d’une solution d’acide sulfurique titré, la transformation des carbonates et bicarbonates

en sulfates, permet de connaître la qualité d’hydrate alcalin et la moitié des carbonates.

Appareillage et réactifs :

- Burette de 100 ml.

- Bêcher de 150 ml.

- Phénolphtaléine à 1 %.

- Solution d’acide sulfurique (H2SO4 N/10).

Mode opératoire :

Introduire 50 ml d’eau dans un bêcher, ajouter quelque gouttes de phénolphtaléine (03 gouttes),

s’il ne se produit pas de coloration rose le titre (TA) égale à zéro(0).

S’il y apparition du rose, cette coloration fait appel au titrage par la solution sulfurique jusqu’à

décoloration complète de la solution à solution à laid d’une burette graduée.

- Noter le volume (V) lue sur la burette.

Expression des résultats :

Le TA est exprimé en degré français.

Avec : V : volume lu sur la burette en ml.

a.2) Titre alcalimétrique complet (TAC) :

TA= V × 5


Principe :

Le TAC correspond à la teneur de l’eau en alcalin libre, carbonates et les bicarbonates, le titrage

se fait par la solution sulfurique servant de méthyle orange comme indicateur.


- Burette graduée de 100 ml.


- Méthyle orange.

- Solution acide sulfurique (H2SO4 N/10).

Mode opératoire :

Prendre 50 ml d’échantillon, additionner quelques gouttes de méthyle orange, après verser

lentement à l’aide d’une burette graduée de l’acide sulfurique, en agitant constamment jusqu’à

virage du jaune au jaune orange. Noter le volume (V) lu sur la burette.


Le TAC est exprimé en degré français.

Avec :

V= volume de solution utilisé pour le titrage en ml.

0.1= normalité de la solution sulfurique.

b) Détermination du titre hydrométrique (TH) :

Principe :

Le TH correspond à des concentrations métalliques, la dureté de l’eau est due principalement aux

ions alcalino-terreux : Ca+2 et Mg+2.

Appareillages et réactifs :

- Burette graduée 100 ml.


- Pipette de 2 ml.

- Solution noire Eriochrome.

- Solution tampon pH = 10.

TAC = (V – 0.1) × 5


- Solution EDTA de 0,01 N (éthylène – diamine tétra acétique).

Mode opératoire :

Introduire 100 ml d’eau dans un bêcher et ajouter 2 ml de solution tampon (pH=10), ensuite

additionner quelques gouttes de noire Eriochrome, le virage aux bleu indique un pH = 0. Si la

coloration vire vers le violet, le titrage se fait par la solution EDTA jusqu’au virage bleu.


On lit directement le volume EDTA versé, qui est égal au titre hydrométrique (TH) exprimé en

degré français.

Avec :

V : volume de l’EDTA en ml.

4.2.2. Poudre de lait :

La poudre de lait est un produit très hygroscopique, les échantillons prélevés sont conservés en

récipients étanches, de capacité égale à environ deux fois le volume de poudre de lait prélevé,

mais avant d’effectuer l’analyse, il faut homogénéiser bien l’échantillon en agitant le flacon par

mouvements de retournements répétés.

a) Détermination du taux d’humidité :

Un lait en poudre de bonne qualité doit présenter une humidité inférieure à 4%, l’intérêt de

mesurer l’humidité de la poudre du lait est de connaître la conduite rationnelle des opérations de

transports, stockage et de transformation industrielle.

Principe :

Elimination de l’eau contenue dans la poudre de lait par dessiccation et détermination du taux

d’humidité exprimé en pourcentage.

Appareillage :

- Capsule d’aluminium.

- Dessiccateur.

Mode opératoire :

TH = V (EDTA)


Introduire dans une capsule 1,2g de poudre et déposer la capsule dans le dessiccateur, ensuite

mettre l’appareil en marche.


Lire directement sur le dessiccateur le taux d’humidité en pourcentage.

b) Détermination de l’acidité titrable :

Principe :

Le lait présente une acidité qui peut être titrée par une solution d’hydroxyde de sodium en

présence de Phénolphtaléine servant d’indicateur.


- Bêcher 150 ml.

- Pipette de 10 ml.

- Acidimétrie dornic.

- Solution de soude (NaOH N/9).

- Indicateur Phénolphtaléine.

- Eau distillée.

Mode opératoire :

Peser 02g de poudre dans un bêcher et ajouter 18 ml d’eau distillée, laisser au repos pendant 5

minutes, en suite, en titre le mélange à l’aide de la soude (NaOH N/9) après avoir ajouté quelques

gouttes de Phénolphtaléine jusqu’au virage rose pâle.


L’acidité titrable est exprimée en degré dornic, elle est donner par la formule suivante :

Avec :

A : l’acidité de la poudre.

V : volume versé de NaOH en ml.

c) Détermination de la teneur en matières grasse :

A = V/2


Principe :

C’est la dissolution des éléments du lait sec, matières grasse exceptée par l’acide sulfurique sous

l’influence de la force centrifuge et grâce à l’adjonction d’une petite quantité d’alcool iso

amylique, la matière grasse se sépare.

Appareillages et réactifs :

- Butyromètre de Teichert avec son bouchon.

- Centrifugeuse GERBER.

- Balance analytique de précision.

- Acide sulfurique de densité 1,825.

- Alcool iso amylique.

- Eau distillée.

Mode opératoire :

Introduction dans un butyromètre 10 ml d’acide sulfurique et ajouter 8 ml d’eau distillée, en

suite ajouter 2.5 g de poudre de lait après l’avoir peser sur une balance analytique, et à la fin,

additionner 1 ml d’alcool iso amylique.

Boucher le butyromètre et agiter latéralement avec prudence puis centrifuger à 1020 tours par

minutes pendant 6 minutes.


Lire directement sur le butyromètre gradué, le pourcentage de la matière grasse est donné par la

formule suivante :

d) Mesure de pH :

Principe :

Il s’agit de décrire la mesure électrométrique du pH (acidité ionique), la dissolution de la poudre

dans l’eau est obligatoire pour avoir une mesure correcte du pH.

Appareillages :

- pH-mètre avec électrode en verre.

- Balance analytique.

- Réfrigérateurs (T° : 2 à 5°C).


Mode opératoire :


Peser 03 g d’échantillon dans un bêcher et ajouter 30 ml d’eau distillée, à l’aide d’une baguette

en verre, en mélange jusqu’à dissolution complète, après placer le mélange dans le réfrigérateur

pendant quelques minutes pour avoir une température de 10 à 15°C, puis introduire l’électrode.


Après stabilisation des chiffres, lire directement la valeur du pH sur le pH-mètre.

4.2.3. Lait reconstitué, lait après pasteurisation et produit fini (lait UHT) :

Les analyses physico-chimiques effectuées sur le lait reconstitué, après pasteurisation et produit

fini, nous permettent de contrôler et de suivre la qualité du lait UHT.

4.2.3.1. Analyse de lait reconstitué, après pasteurisation et le lait UHT avant

incubation :

a) Détermination de la densité :

Principe :

C’est le rapport entre la masse d’un volume du lait et celle d’un même volume d’eau, elle est

définie comme étant la masse volumique du lait, elle est exprimer en Kg/m3, on détermine la

densité du lait à l’aide d’un thermo lactodensimètre.

Appareillage :

- Thermo lactodensimètre.

- Eprouvette à bec de 250 ml.

Mode opératoire :

Remplir l’éprouvette de manière à ce que le lait déborde légèrement pour éliminer la trace de

mousse, le lactodensimètre est plongé verticalement dans l’éprouvette, après sa stabilisation, on

prend la température du lait dans l’éprouvette et noter la densité.


Le lactodensimètre donne une valeur exacte à température 20°C, si la température est supérieure

ou inférieure, il est nécessaire d’effectuer une correction par une dés deux équations suivantes :

Si la T° lue < 20°C

Si la T° lue > 20°C

Avec :

D lue = densité lue sur thermo lactodensimètre

D = D lue – 0,2 (20 – T° lue)

D = D lue + 0,2 (T° lue – 20)


T° lue = température lue sur thermo lactodensimètre.

0,2 est le coefficient de correction.

b) Détermination de l’acidité titrable :

Principe :

L’acidification du lait est due à la transformation du lactose en acide lactique par les bactéries

lactiques, ceci, par une réaction de neutralisation de l’acide lactique qui est titré par la soude

(NaOH N/9), en présence de phénolphtaléine comme indicateur coloré.


- Burette graduée.

- Pipette de 10 ml.


- Solution de soude (NaOH N/9).

- Solution alcoolique de phénolphtaléine.

Mode opératoire :

Introduire dans un bêcher 10 ml de lait, et ajouter quelques gouttes de phénolphtaléine (03

gouttes) après, avec la solution de soude en titre jusqu’à début de virage au rose pâle.


L’acidité titrable est exprimée en degré dornic.

c) Détermination de la teneur en matière grasse :

Principe :

C’est la dissolution des éléments du lait, la matière grasse excepté par l’acide sulfurique sous

l’influence de la force centrifuge et grâce à l’adjonction d’une petite quantité d’iso amylique (1

ml), la matière grasse se sépare en une couche claire et transparente.


- Butyromètre du lait « GERBER ».

- Pipette de 11 ml graduée.

- Bouchon pour butyromètre + poussoir.

- Centrifugeuse « GERBER ».

- Alcool iso amylique avec son doseur de 1 ml.

- Acide sulfurique avec son doseur de 10 ml. (densité = 1,825)


Mode opératoire :

Introduire dans un butyromètre 10 ml de l’acide sulfurique (D = 1,825) et ajouter 11 ml de lait, et

en rajouter 1 ml d’alcool iso amylique, boucher le butyromètre et on mélange bien, puis placer le

butyromètre dans la centrifugeuse à 1020 tours par minutes pendant 6 minutes.


On lit directement sur le butyromètre les graduations contenant la matière grasse visiblement

séparé, est exprimé en g/l.

d) Détermination de l’extrait sec total (EST) :

Principe :

L’extrait sec est la masse restant après une dessiccation complète basée sur l’évaporation de

l’eau d’un certain volume donné de lait.

Appareillages :

- Capsule en verre.

- Papier buvard.

- Pipette de 10 ml.

- Balance analytique de précision.

Mode opératoire :

Poser du papier buvard dans une capsule bien sèche et la peser à l’aide de la balance analytique,

puis introduire 10 ml du lait dans la capsule, mettre cette dernière dans le micro-onde à 250 W

pendant 12 minutes, après peser à nouveau la capsule ressortit de micro-onde.


L’EST est calculé par la formule suivante :

Avec :

P0 = poids de la capsule vide en gr.

P1 = poids de la capsule après la dessiccation en gr.

E = prise d’échantillon.

e) Détermination de l’extrait sec dégraisse (ESD) :

L’extrait sec dégraisse est calculé par la formule suivante :

ESD = P0 – P1 × 1000E

ESD = EST – MG


Avec :

ESD = Extrait sec dégraisse en g/l.

EST = Extrait sec total en g/l.

MG = Matière Grasse en gr.

f) Mesure de pH :

Versé une quantité de lait dans un bêcher, et à l’aide du pH-mètre déterminer la valeur du pH.


Lire directement la valeur du pH inscrite automatiquement par le pH-mètre.

4.2.3.2. Analyse du lait UHT après incubation :

Dés que la durée d’incubation c’est achevée, on fait sortir les boites du lait UHT et on établie

deux analyses physico-chimique :

A) Détermination de l’acidité titrable.

B) Mesure de pH.

A) Détermination de l’acidité titrable :

Voir 2.3.1 - b)

B) Mesure de pH :

Voir 2.3.1 – f

4.3. Les analyses organoleptiques :

Ce sont des critères de contrôle de qualité essentiels pour certains produits alimentaires et

secondaire pour d’autre, il consiste à contrôler l’apparence, la saveur et la flaveur de la denrée.


Dans notre étude on a observé que ses analyses ne prennent pas une grande importance pour le

personnel du laboratoire, cette ignorance est justifie par l’absence de changement des caractères

organoleptique du lait stérilisé UHT sauf pour le goût de cuisant observé, qui est obtenu grâce au

traitement thermique subit.

13.analyses microbiologiques

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