1° symposium thermal européen - aix-les-bains protocole détude du potentiel chondroprotecteur des...

1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

Protocole d’étude Protocole d’étude du potentiel chondroprotecteur du potentiel chondroprotecteur

des eaux minérales des eaux minérales in vitroin vitro

Jean Cambar, Béatrice L’Azou, Christian Toussaint, Céline OhayonJean Cambar, Béatrice L’Azou, Christian Toussaint, Céline Ohayon

Faculté de Pharmacie – EA 3672Faculté de Pharmacie – EA 3672

Université Victor Segalen - Bordeaux 2, FranceUniversité Victor Segalen - Bordeaux 2, France


Le contexte : le thermalisme et l’arthrose

Orientation Rhumatologie : 135 000 curistes (30% de la fréquentation)

Arthrose : 81 000 curistes (60% des curistes en RH) Avantages du thermalisme

Baisse de la douleur Diminution de la consommation de médicaments Traitement non agressif Mécanismes d’action ?

Techniques thermales, prise en charge globale du patient.. Propriétés physiques et/ou chimiques des produits

thermaux


La démarche générale de notre équipe

Hypothèse : certains éléments minéraux connus pour leur tropisme pour les os et le cartilage, auraient des propriétés anti-arthrosiques.

Approches envisagées Étude du passage transcutané des éléments

contenus dans l’eau minérale et la boue thermale (cuivre, zinc, strontium, manganèse …)

Recherche de l’activité in vitro de ces éléments sur des modèles cellulaires pertinents


Passage transcutané

Le passage transcutané d’éléments des eaux minérales a déjà été mis indirectement en évidence Par traceurs radioactifs (Dubarry, Tamarelle, 1971 - 1972)

Par mesure des niveaux sériques (Sukenik, 1992)

Protocole de nos études antérieures Cellule de diffusion (Franz) sur peau humaine avec

compartiment de recueil contenant du plasma humain Modalités expérimentales proches des pratiques thermales

(applications répétées de boue ou d’eau) Dosage spectrométrique des éléments dans le plasma de

recueil Aucun passage : fer, sodium, potassium, chlorure, calcium Passage : manganèse, strontium, zinc et cuivre


Arthrose et modèles cellulaires in vitro

Mécanismes de l’arthrose encore mal connus Principalement lié à un dysfonctionnement de la cellule

constitutive du cartilage, le chondrocyte

Déséquilibre entre les phénomènes d’anabolisme et de catabolisme du cartilage articulaire : le chondrocyte est anormalement stimulé et dysrégulé.

L’utilisation de cultures cellulaires de chondrocytes représente un modèle d’étude pour mettre en évidence les modifications métaboliques survenant dans le cartilage.


Intérêt des modèles in vitro

Contributions reconnues et déjà validées des modèles in vitro en pathologie et en thérapeutique.

Déjà des références en thermalisme avec des modèles de fibroblastes, de cellules musculaires,..

Corrélations avec les études sériques de marqueurs de l’inflammation chez des patients arthrosiques;


Présentation du projet

Choix des éléments à tester : Sr et Mn Choix du modèle cellulaire : chondrocytes humains sains

en primoculture Objectifs

Valider le modèle cellulaire (amplification et différentiation) Déterminer la viabilité et la prolifération cellulaires en

présence de Sr et de Mn (pour définir les doses et la durée d’exposition)

Caractériser certains marqueurs de la matrice extracellulaire Mesurer l’effet du Sr et Mn sur la balance

synthèse/dégradation des constituants de la MEC Étude retenue par l’AFRETH pour un financement d’une durée

de 1 an


Choix des éléments

Le strontium cation bivalent avec une forte affinité pour l’os, effet bénéfique, soit sur la production de la MEC (stimule la

production de protéoglycannes), soit par inhibition de la dégradation du cartilage dans l’arthrose,

Le manganèse rôle dans la constitution d’enzymes et de métalloenzymes, optimise la production des glycosaminoglycannes et donc

des protéoglycannes,

Vérifier l’action du strontium, du manganèse et de leur association sur cultures de chondrocytes humains


Choix du modèle cellulaire

Primoculture de cellules

cartilagineuses humaines saines

Disponibles dans le commerce

Garanties pour Conservation du phénotype

si ≤ 10° doublement de population

Production de collagène II


Objectif 1 : validation du modèle de culture

Difficultés : maintenir les

chondrocytes dans un état différencié stable

tout en permettant la multiplication des cellules

Plusieurs modèles de cultures testés Choix de primo-

cultures de chondrocytes de veau


Choix du modèle

Matériel facilement disponible : primocultures de chondrocytes de veau (A.M. Freyria, ibcp, Lyon)

1° approche : culture organotypique, culture sur biomatériaux ou sur gel, culture en suspension Maintien du phénotype Faible production de cellules Méthodes complexes Incompatibles avec les tests réalisés

2° approche : culture en monocouche sur des surfaces spécifiques (laminine, collagène I) Multiplication des cellules Méthodes plus simples Phénotype instable

Laminine Collagène I Ac Coll. I

Agarose 2%


Choix du modèle

3° approche : culture en monocouche sur plastique Méthodes plus simples,compatibles avec nos études Augmentation du pouvoir prolifératif Phénotype variable selon l’origine des cellules

(espèces, âge) et la densité cellulaire

Faible densité Forte densité

Approche retenue : culture en forte densité, en vérifiant le phénotype (méthodes immunochimiques et de biologie moléculaire)


Objectif 2 : études de la viabilité

Permettent de déterminer les doses de Sr et Mn non toxiques à utiliser et de quantifier un éventuel pouvoir prolifératif.

Phase préliminaire sur lignée de cellules mésangiales humaines (IP15) Matériel cellulaire disponible au laboratoire en grande

quantité (lignée stable) Matériel humain produisant de la matrice extracellulaire

Phase de confirmation sur chondrocytes de veau


Résultats de viabilité cellulaire (IP15)

Méthodologie : Utilisation d’un colorant

vital (rouge neutre) Mesure de l’intégrité

membranaire (lysosomes)

Évaluation du nombre de cellules vivantes

Etude de la viabilité cellulaire sur cellules mésangiales humaines

0

20

40

60

80

100

120

1 ng 10 ng 100 ng1 µg 10 µg 100 µg 1 mg 10 mg

% Cellules vivantes

Strontium

Manganèse

Etude de la viabilité cellulaire sur cellules mésangiales humaines

0

20

40

60

80

100

120

1 µg 10 µg 1 mg

% Cellules vivantes

Strontium

Manganèse

24 h

72 h


Résultats de la prolifération cellulaire (IP15)

Méthodologie : Utilisation d’un colorant

vital (rouge neutre) Mesure de l’intégrité

membranaire (lysosomes) Évaluation du nombre de

cellules vivantes en fonction du temps

Etude de la prolifération cellulaire (Strontium)

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

J1 J2 J3 J6 J7

Abs

Témoin

1 ng

10 ng

100ng

1 µg

10 µg

100 µg

1 mg

Etude de la prolifération cellulaire (manganèse)

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

J1 J2 J3 J6 J7

Abs

Témoin

1 ng

10 ng

100 ng

1 µg

10 µg

100 µg

1 mg


Confirmation des résultats sur chondrocytes

Le Sr et le Mn n’induisent aucune mort cellulaire, ni prolifération cellulaire, quelle que soit la dose utilisée.

Etude de la viabilité cellulaire sur cellules de chondrocytes de veau

0

20

40

60

80

100

120

1 ng 10 ng 100 ng1

µg10

µg

100 µg

1 mg

% Cellules vivantes

Strontium

Manganèse

72 h

Choix des doses de l’étude Sr : 0,01 - 0,1 et 1 mg/ml Mn : 1 - 10 et 100 µg/l

Choix de la durée d’exposition 72 h, 7 j et 21 j

Compatibles avec les résultats des études du passage transcutané et les pratiques thermales


Objectif 3 : marqueurs de la MEC

Mise en évidence et quantification des constituants majoritaires de la MEC synthétisés par les chondrocytes (libérés dans le surnageant et/ou ancrés sur les cellules) Collagènes

méthode biochimique colorimétrique (rouge de Sirius, kit Biocolor, Sircol™)

quantification de tous les collagènes solubles Protéoglycannes

méthode biochimique colorimétrique (bleu de méthylène, kit Biocolor, Blyscan™)

quantification des glycosaminoglycannes sulfatés


Résultats de l’étude des marqueurs de la MEC

Niveau basal des GAGs (veau et homme)

Niveau basal Collagène Niveau basal très élevé (biais méthodologique,

présence de collagène dans le milieu de culture) Nécessité de mettre en œuvre la RT-PCR pour utiliser

ce marqueur

Chondrocytes de veauGAG (niveau basal J3)

0

1

2

3

4

5

GAG MEC GAG Milieu

[µg/puits

]

0

1

2

3

4

5

GAG MECGAG Milieu

Chondrocytes HumainGAG (niveau basal)

0

1

2

3

4

5

6

GAG MEC GAG Milieu

[µg/puits

]

J3

J7

J21

0

1

2

3

4

5

6

GAG MECGAG Milieu


Objectif 4 : effet du Sr et Mn sur la MEC

Cellules de chondrocytes de veau Pas de modification du niveau basal

Pas d’action cellulaire directe sur les marqueurs choisis

Envisager d’autres marqueurs comme les cytokines pro-inflammatoires (MMP, TIMPs) et les IL.

GAG dans la MEC

0

2

4

6

8

10

Témoin Sr 1 mg Mn 1 mg Sr+Mn 1 mg

[µg/cm2]

GAG dans le milieu extracellulaire

0

1

2

3

4

5

6

Témoin Sr 1 mg Mn 1 mg Sr + Mn1 mg

µg/puits


Effet du Sr et Mn en présence d’IL-1

Nécessité de mettre en œuvre une autre approche : effet potentiel de restauration en présence d’agents catabolisants (IL-1) pour mimer les chondrocytes arthrosiques.

GAG dans la MEC des cellules humaines

0

25

50

75

100

Témoin Témoin IL1b Sr IL1b 1 mg/l Mn IL1b 100µg/l

%/Témoin

GAG dans le milieu extracellulaire des cellules humaines

0

25

50

75

100

Témoin Témoin IL1b Sr IL1b 1 mg/l Mn IL1b 100µg/l

% Témoin


Conclusion

Cette étude réalisée in vitro sur chondrocytes permet de disposer d’un modèle d’étude rapide de l’effet des

éléments minéraux contenus dans les produits thermaux, d'étudier l’effet de ces éléments sur la production des

constituants majoritaires de la matrice extracellulaire, d’évaluer leur effet sur la balance synthèse/dégradation de la

MEC

Mais, il sera nécessaire de mettre en œuvre des moyens supplémentaires (de biologie moléculaire, d’immuno-histochimie et biochimiques) pour approfondir les mécanismes impliqués.

1° symposium thermal européen - aix-les-bains protocole détude du potentiel chondroprotecteur des...

Documents