1. protéines -...

of 28 /28
http://www.chusa.upmc.fr/disc/bio_cell PCEM1 1. Protéines CAHIER D'EXERCICES de BIOCHIMIE 2009-2010 EDITE PAR LE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Upload: dinhdiep

Post on 22-Jul-2018

247 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

http:/ /www.chusa.upmc.fr/disc/bio_cel l

PCEM1

1. Protéines

CAHIER D'EXERCICES de BIOCHIMIE

2009-2010

EDITE PAR LE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Page 2: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 2

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

CAHIER D'EXERCICES POUR PCEM1

BIOCHIMIE

I . P R O T E I N E S

S O M M A I R E Page

1. Techniques d'étude des protéines . . . . . . . . 3

2. Structure des protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3. Fonction des protéines . . … . . . . . . . . . . . . 12 4. Enzymologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4.1 Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4.2 Enzyme Michaëlien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.3 Enzyme Allostérique . . . . . . . . . . . . . . . . … 17 5. Problèmes de révision . . . . … … . . . . . . . . . 17 6. Annales du concours : QCM et QROC … . 21

Image de couverture : Structure d'un cristal de BRCA2, une protéine déficiente dans des formes héréditaires de cancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org)

Page 3: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

1. TECHNIQUES D’ETUDE DES PROTEINES 1.1

PM ( kDa )

Ve ( ml )

bleu dextran* 1000 80 uréase 500 90 aldolase 150 115 sérum albumine 65 150 ovalbumine 45 170 chymotrypsinogène 25 190

En chromatographiant des protéines de poids moléculaires connus sur une colonne de gel filtration, on peut déterminer leur volume d’élution (Ve) et tracer une courbe d’étalonnage qui permet d’évaluer le poids moléculaire d’une protéine inconnue. Les données ci-contre sont utilisées pour tracer la courbe d’étalonnage ci-dessous. (* le bleu dextran est un polymère de haut PM) lysozyme 14 200

Une protéine X, chromatographiée dans les mêmes conditions expérimentales, est éluée à un volume d’élution de 130 ml.

a- Justifier l’ordre d’élution des protéines de PM connus. b- Evaluer le PM de la protéine X.

Cette protéine X est ensuite analysée par électrophorèse SDS-PAGE, et on détecte une seule bande correspondant à un PM apparent de 25 kDa. Après traitement de la protéine X par un excès de β-mercaptoéthanol, la même analyse par électrophorèse ne donne toujours qu’une seule bande à 25 kDa.

c- Sur quel principe est basée la détermination du PM apparent mesuré par électrophorèse SDS-PAGE? En quoi diffère-t-il de la chromatographie par gel filtration ?

d- Que peut-on dire des ponts disulfures de la protéine X ? e- Proposer une structure schématique pour la protéine X

1.2 a. Dans le but de collecter les protéines du cytosol, un homogénat cellulaire de cerveau de souris est soumis à des centrifugations de vitesse croissante :

- 1ere centrifugation : 1000g pendant 10 minutes. - 2ème centrifugation : 20000g pendant 20 minutes. - 3ème centrifugation : 80000g pendant 1 heure. - 4ème centrifugation de 150000g pendant 3 heures. Parmi les différents culots et surnageants obtenus, indiquer celui qui ne contient que les protéines du cytosol ?

20 30 50 70 200 300 500 700

Volume d’élution

PM (kDa)

Page 4: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 4

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

b.Les protéines sont extraites de cette fraction cytosolique et soumises à une

chromatographie d’affinité qui permet de purifier une protéine. - Une chromatographie de filtration sur gel de la protéine purifiée indique la présence

d’une protéine majoritaire d’une masse moléculaire d’environ 100 000 daltons. - La protéine purifiée est ensuite analysée par électrophorèse SDS-PAGE. On détecte deux

bandes majoritaires de 75 000 et 25 000 daltons. - La même analyse est réalisée sur un deuxième échantillon de la fraction purifiée

préalablement traitée par le β-mercaptoéthanol. On détecte alors deux bandes de 50 000 et 25 000 daltons.

Que peut-on déduire de ces données quant à la structure de la protéine purifiée ? 1.3 Expliquer et commenter ces affirmations. a. La solubilité minimale d’une protéine est atteinte à son point isoélectrique (pHi). b. Pour une valeur de pH supérieure à son pHi, une protéine porte toujours une

chargée négative et pour une valeur de pH inférieure à son pHi, une protéine porte toujours une charge positive.

c. L’ajout d’une quantité importante de sulfate d’ammonium entraîne la précipitation de nombreuses protéines.

1.4 Une solution contenant de l’albumine (pHi= 4,6), de la β-lactoglobuline (pHi = 5,2) et du

chymotrypsinogène (pHi= 9,5) est chargée sur une colonne de DEAE cellulose à pH 5,4. (Le DEAE est une molécule chargée positivement)

La colonne est éluée par un gradient de NaCl de concentration croissante. • Proposer un ordre d’élution de la colonne pour ces protéines.

1.5 Soit une protéine (A) oligomérique d’un poids moléculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sa

structure quaternaire est étudiée par la détermination des poids moléculaires à l’issue de divers traitements:

a. Traitement par le β-mercaptoéthanol 0,1M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 120 000 Da.

b. Traitement par l’urée 4M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 80 000 Da.

c. Traitement par le β-mercaptoéthanol 0,1M et l’urée 4M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 40 000 Da.

• Quels sont les effets de ces différents traitements ? • Ces résultats ont-ils été obtenus par gel-filtration ou SDS-PAGE ? • Proposer un volume d’élution en gel filtration sur la colonne de l’exercice 1.1 de

la protéine (A) dans un tampon 0.1M β-mercaptoéthanol. • Proposer un schéma de migration de la protéine (A) en SDS-PAGE. • Quelle est la structure quaternaire de cette protéine ?

1.6 Influence du pH sur la conformation d’un peptide. Le squelette peptidique est flexible. Il se replie de manière adéquate pour associer les résidus chargés par des liaisons ioniques (dans cet exemple). Ce peptide possède des conformations variables en fonction du pH. A l’aide des valeurs de pKa des acides aminés données ci-dessous, attribuer aux pH suivants : pH 2, pH 5,5 pH 7, pH 11 et pH 13 une des conformations proposées pour le peptide étudié.

Page 5: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 5

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

B

C

D

E

A

1.7 On se propose de purifier, à partir de sérum humain, la protéine de transport plasmatique des hormones sexuelles, dénommée TEBG (testosterone estradiol binding globulin) » ou encore SBP (sex steroid binding protein). La TEBG présente la propriété de lier de façon non covalente et avec une forte affinité la testostérone et l’estradiol. Cette propriété est mise à profit pour suivre les différentes étapes de la purification de la TEBG : après incubation du sérum avec de la testostérone radioactive qui joue le rôle de traceur, on suit le complexe TEBG-testostérone radioactive en mesurant la radioactivité. Ces étapes sont résumées ci-dessous :

a. Traitement du sérum par du sulfate d’ammonium à 50% de saturation et centrifugation.

a.1 Quel est l’intérêt de ce traitement ?

a.2 La radioactivité est mesurée dans le culot et dans le surnageant et on constate que seul le culot est radioactif : sur laquelle des fractions (culot ou surnageant) faut-il poursuivre la purification ?

b. La fraction choisie en (a.2) est dialysée contre du tampon phosphate 20 mM, pH 6, NaCl 50 mM.

Quel est l’intérêt de cette étape de dialyse à ce stade de la purification ?

c. La solution obtenue en (b) est chromatographiée sur une résine échangeuse d’anions ; diverses protéines, dont une fraction radioactive, sont éluées par diminution progressive du pH jusqu’à 5.

c.1 Sur quelle propriété des protéines est basée la chromatographie sur résine échangeuse d’ions ?

c.2 Que peut-on dire du pHi de la TEBG ?

d. La fraction radioactive isolées en (c) est déposée sur une colonne de chromatographie par gel filtration (Sephadex G100) et éluée par un tampon phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Le profil d’élution est représenté sur le schéma ci-dessous (DO = densité optique). La colonne de Sephadex G100 a été préalablement calibrée avec 4 protéines de masses moléculaires connues dont les volumes d’élution respectifs sont indiqués sur ce même schéma (flèches).

AA pKa

chaîne extrémité latérale terminale

Asp 3,9

Glu 4,1

His 6,0

Lys 10,5

Arg 11,5

C-terminal 4,2

N-terminal 10,6

Page 6: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 6

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

d.1 Sur quelle propriété des protéines repose la filtration sur gel ? d.2 A quoi correspond la DO mesurée à 280 nm et que permet-elle de suivre ? d.3 Peut-on dire que la fraction radioactive isolée en (c) et chromatographiée ici était

très pure ? d.4 Proposer une valeur de volume d’élution pour la TEBG. d.5 En utilisant la grille semi-log ci-dessous, donner une estimation du poids moléculaire

de la TEBG.

e. Une aliquote de la fraction radioactive obtenue en (d) est analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes (absence de SDS), à pH 7. Le gel ainsi obtenu est traité par le bleu de Coomassie (coloration spécifique des protéines) puis scanné dans un détecteur de radioactivité, ce qui permet de voir à quelle bande de l’électrophorèse est associée la radioactivité. Les résultats sont schématisés dans la figure ci-dessous, A. e-1 Sur quelle propriété est basée l’électrophorèse utilisée ici ? Quelle est la

différence avec l’électrophorèse pratiquée en présence de SDS ? e-2 Que peut-on dire de la pureté de la fraction radioactive obtenue en (d)

f. Compte tenu des propriétés biologiques de liaison de la TEBG, proposer une technique de

purification de cette protéine.

10 20 30 40 50 60 70 80 90

DO 280 nm Radioactivité

Ve (ml)

94 kDA (10 ml)

68 kDA (30 ml)

43 kDA 60 ml)

30 kDA (80ml)

70

50

30

20

Ve (ml)

PM (kDa)

Page 7: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 7

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

g. On utilise la technique mentionnée en (f) et on obtient une nouvelle fraction radioactive que l’on analyse comme en (e) (figure ci-dessous, B) : que peut-on dire de cette dernière fraction obtenue, en terme de pureté ?

h. Sur la fraction purifiée obtenue en (g) on étudie la structure quaternaire de la TEBG en utilisant la technique de filtration sur gel comme en (d), dans différentes conditions expérimentales :

1- dépôt dans des conditions natives. 2- dépôt après traitement par l’urée 8M. 3- dépôt après traitement par l’urée 8M et le mercaptoéthanol en excès.

Les résultats sont résumés dans la figure suivante.

Proposer une interprétation de ces derniers résultats

2. STRUCTURE DES PROTEINES

2.1 Citez le ou les acide(s) aminé(s) correspondant à chacune des propriétés suivantes : a. sa chaîne latérale possède un atome de soufre, mais pas de groupement thiol. b. possède un groupement α aminé substitué

c. sa chaîne latérale est aromatique et phosphorylable. d. joue un rôle important dans le maintien de la structure des protéines par la capacité de

sa chaîne latérale à établir des liaisons covalentes réversibles par oxydoréduction.. e. est capable de former des liaisons H par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. f. est capable de former des liaisons ioniques par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. g. possède une chaîne latérale à fonction basique majoritairement non chargée à pH7. h. sa chaîne latérale contient une fonction amide.

i. possède à pH7 un très fort excédent de charges (+).

radioactivité

dépôt

+

Sen

s de

mig

ratio

n

A

Etape (e)

radioactivité +

B

Etape (g)

DO 280 nm

Ve (ml)

94 kDA (10 ml)

68 kDA (30 ml)

43 kDA (60 ml)

10 20 30 40 50 60 70

1 2

3

Page 8: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 8

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

2.2 Caractéristiques des acides aminés • Quelle partie de la molécule d'un acide aminé permet de le classer dans les acides aminés

polaires ou apolaires ? • Définir les séries D et L pour les acides aminés.

. A quelle série appartiennent les acides aminés constitutifs des protéines chez l’homme ?

2.3 La liaison peptidique : • Donner une définition et décrire son mode de formation. • Citer les trois principales caractéristiques structurales d'une liaison peptidique. • La mesure de la longueur de la liaison C-N entre deux acides aminés est de 0,132 nm,

donc intermédiaire entre une liaison simple C-N (0,149 nm) et une double liaison C=N (0,127 nm).

Quelles indications ce résultat donne-t-il sur certaines propriétés de la liaison peptidique et sur les possibilités de rotation autour de cette liaison ?

2.4 Soient les peptides suivants :

( 1 ) V a l - L e u - M e t - T y r - P h e - G l y - L e u - A l a - T r p - G l y ( 2 ) A l a - V a l - G l u - A l a - L e u - A r g - I l e - V a l - G l u - S e r

a. Lequel de ces deux peptides présente la plus forte probabilité d’adopter une conformation en hélice α?

b. Dans le peptide (2), l’acide aminé numéro 6 est muté en proline : Quelles sont les conséquences pour la structure du peptide?

c. Quelles sont les conséquences du traitement à l’urée de ces deux peptides ? d. Pourquoi les protéines transmembranaires ont-elles une proportion importante de

structure en hélice ? e. Le peptide (2) possède des propriétés amphiphiles. Pourquoi ?

2.5 Dans une protéine globulaire hydrosoluble, quels acides aminés dans la liste suivante :

méthionine, histidine, arginine, phénylalanine, valine, glutamine, acide glutamique, pensez vous trouver :

a. à la surface de la protéine ? b. à l’intérieur de la protéine ?

2.6 Décrire les liaisons labiles impliquées dans la formation de l'hélice α du type le plus souvent

rencontré dans la structure secondaire des protéines. • Quels sont les traitements qui permettent la rupture de ces interactions ? • Quel est l’effet de ces traitements sur les feuillets β ? • Quelles peuvent être les conséquences de ces traitements sur les protéines ?

2.7 Le déroulement d'une hélice α s'accompagne d'une

diminution de son pouvoir rotatoire. L'acide polyglutamique (Glu)n est en conformation d'hélice α à pH3. Quand le pH augmente, le pouvoir rotatoire diminue. De la même façon la polylysine (Lys)n est hélicoïdale à pH 10, mais son pouvoir rotatoire décroît à pH acide.

Expliquez l'effet du pH sur la conformation de (Lys)n et (Glu)n.

Page 9: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 9

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

2.8 On dispose de 3 tripeptides de séquences connues : 1 : Leu-Asp-Leu 2 : Leu-Lys-Leu 3 : Asp-Leu-Lys.

a- On dépose un mélange de ces 3 peptides sur un gel d’électrophorèse à pH 7 (sans SDS) et, après migration et révélation, on observe le schéma ci-dessus : Compte tenu de la polarité indiquée, à quels peptides correspondent les taches notées a, b et c ?

b- Le même mélange est analysé sur un gradient de pH 3-10. En utilisant une représentation similaire à la question précédente, indiquer la position relative de ces 3 peptides après migration, selon que le mélange est déposé aux extrémités droite ou gauche, ou bien au milieu du gel. (Préciser sur le schéma les zones acide et basique ainsi que la polarité des électrodes).

2.9 L’hydrolyse totale d’un octapeptide P8 permet d’identifier les acides amines suivants :

Ala , Asp , Arg , 2 Gly , Phe , Ser et Val Il est possible, par action d’une aminopeptidase sur un peptide, d’identifier l’acide aminé qui est en position N-terminale ; de même, une carboxypeptidase permet d’identifier l’acide aminé en position C-terminale. L’action de la trypsine sur P8 fournit un tripeptide TP3 et un pentapeptide TP5 ; le traitement de P8 par la chymotrypsine fournit un tripeptide CP3 et un pentapeptide CP5. Tous ces peptides sont isolées et traités indépendamment par l’aminopeptidase et par la carboxypeptidase et les acides aminées ainsi mis en évidence sont indiqués dans le tableau suivant :

Aminopeptidase Carboxypeptidase

P8 Ala Val

Trypsine TP3 Ser Val TP5 (non précisé) (non précisé)

Chymotrypsine CP3 (non précisé) (non précisé) CP5 Asp Val

A partir de ces indications, déduire la séquence du peptide P8.

2.10 Dénaturation réversible de la ribonucléase.

La ribonucléase (RNase) est une petite protéine de 124 acides aminés qui contient 8 cystéines associées par 4 ponts disulfures intra-caténaires. On incube cette ribonucléase dans un tampon phosphate (TP) additionné ou non de βmercaptoéthanol (βME) et/ou d’urée 8M, avec ou sans étape de dialyse, et on dose les thiols libres et l’activité ribonucléasique du composé obtenu :

Test Composé

testé Conditions expérimentales d’incubation Composé

obtenu Thiols libres

Activité %

Témoin Rnase TP 0 100 1 Rnase TP + βME en excès 0 100 2 Rnase TP + urée 8M + βME en excès p1 8 0 3 p1 dialyse contre tampon phosphate p2 0 ~100 4 p1 dialyse contre TP et urée 8M p3 0 0 5 p3 dialyse contre TP p4 0 ~1 6 p4 dialyse contre TP et βME en petite quantité p5 0 ~100

a. Rappeler l’effet de l’urée 8M et du β-mercaptoéthanol en excès sur une protéine.

a c b

dépôt

Page 10: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 10

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

b. Préciser la composition du milieu d’incubation pour les tests 3 à 6 en cochant les cases adéquates du tableau suivant :

c. Comment peut-on interpréter la différence de résultat entre les tests 1 et 2 ? d. Comment expliquer le passage de 8 thiols libres à 0 entre les tests 2 et 3 ? e. Comment expliquer le restauration de l’activité enzymatique entre les tests 5 et

6 ? f. Que peut-on conclure sur la relation structure-activité enzymatique de la

ribonucléase ? 2.11 Les mutations pathologiques de la protéine α1-antitrypsine par les méthodes de la

protéomique. La protéine α1-antitrypsine est importante pour la régulation par inhibition de l’activité de plusieurs « sérine-protéases ». En particulier lorsque l’α1-anti-trypsine est déficiente, la limitation dans le poumon de l’activité enzymatique de l’élastase n’est pas assurée et le développement d’un emphysème pulmonaire est accéléré. La détection de l’anomalie moléculaire devient alors nécessaire. On donne ci-dessous la séquence primaire des 394 acides aminés de l’α1-antitrypsine de type « sauvage » (Wt) :

1 E D P Q G D A A Q K T D T S H H D Q D H P T F N K I T P N L 31 A E F A F S L Y R Q L A H Q S N S T N I F F S P V S I A T A 61 F A M L S L G T K A D T H D E I L E G L N F N L T E I P E A 91 Q I H E G F Q E L L R T L N Q P D S Q L Q L T T G N G L F L 121 S E G L K L V D K F L E D V K K L Y H S E A F T V N F G D T 151 E E A K K Q I N D Y V E K G T Q G K I V D L V K E L D R D T 181 V F A L V N Y I F F K G K W E R P F E V K D T E E E D F H V 211 D Q V T T V K V P M M K R L G M F N I Q H C K K L S S W V L 241 L M K Y L G N A T A I F F L P D E G K L Q H L E N E L T H D 271 I I T K F L E N E D R R S A S L H L P K L S I T G T Y D L K 301 S V L G Q L G I T K V F S N G A D L S G V T E E A P L K L S 331 K A V H K A V L T I D E K G T E A A G A M F L E A I P M S I 361 P P E V K F N K P F V F L M I E Q N T K S P L F M G K V V N 391 P T Q K

On peut isoler chez des patients emphysémateux des protéines α1-anti-trypsine anormales présentant des mutations faux-sens (substitution d’un aminoacide par un autre) : - mutation S : E (Glu) 264 → V (Val) - mutation Z : E Glu) 342 → K (Lys) - mutation JD : V (Val) 213 → A (Ala) On connaît également une mutation Sarrebruck (Sarr) où les 19 aminoacides C-terminaux sont tronqués (soulignement simple dans la séquence sauvage).

2.11.1 Donner le nom de la technique de séparation classiquement utilisée dans la cadre de

l’analyse protéomique, en indiquant succinctement son principe (technique I).

Composition du milieu d’incubation Test avant dialyse après dialyse

3 TP Urée βME TP Urée βME

4 TP Urée βME TP Urée βME

5 TP Urée βME TP Urée βME

6 TP Urée βME TP Urée βME

Page 11: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 11

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

2.11.2 Par quelle technique analytique complète-t-on habituellement cette technique de séparation ?

2.11.3 Compléter le tableau suivant, de façon à prévoir comment vont se comporter les 4

protéines α1-anti-trypsine anormales mentionnées par rapport à la protéine sauvage lorsque l’on appliquera la technique I et proposer un schéma des résultats attendus si on soumet un mélange composé de la protéine sauvage et des 4 protéines anormales à cette technique.

aa Wt aa Mutant Conséquence sur la

charge Conséquence sur la

masse Mutant S Mutant Z Mutant JD Mutant Sarr

On s’intéresse à un patient présentant la mutation JD à l’état hétérozygote. Après avoir appliqué la technique I, on repère le spot correspondant à l’α1-anti-trypsine, on l’excise et on pratique une hydrolyse ménagée par la trypsine. On obtient plusieurs peptides, parmi lesquels le peptide 192-217 (double souligné dans la séquence), qui est analysé par spectrométrie de masse : on observe 2 pics, pour des valeurs m/z = 3150 et m/z = 3122. La même analyse appliquée à l’α1-anti-trypsine sauvage ne fait apparaître qu’un seul pic à m/z=3150 2.11.4 Quelle est la spécificité de la trypsine ?

Par rapport à cette spécificité, l’obtention du peptide 192-217 vous paraît-elle normale ? Quelle explication peut-on proposer ?

2.11.5 Comment interpréter la présence des 2 pics chez le mutant JD ? 2.11.6 Le peptide 192-217 est-il phosphorylable ? Justifier. En cas de phosphorylation

exhaustive, calculer la variation de poids moléculaire résultant de cette phosphorylation ; indiquer les modifications de charge électrique attendues et prévoir schématiquement comment ce peptide se comportera par rapport au peptide non phosphorylé si on lui applique la technique I.

2.11.7 Quelle technique chromatographique peut-on envisager pour séparer et isoler la protéine sauvage WT et le mutant JD ?

(Rappel : H = 1 ; C = 12 ; N = 14 ; O = 16 ; P = 31 – Il est précisé que, dans les conditions expérimentales utilisées ici, le pouvoir de résolution de l’électrophorèse SDS-PAGE est d’environ 300 Da : 2 peptides ou protéines ne conduiront à une migration significativement différente que si leur poids moléculaire diffère au moins de 300 Da)

Page 12: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 12

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

3. FONCTIONS DES PROTEINES 3.1 Transport d'O2

Lorsque vous courrez, votre organisme réagit pour bien oxygéner vos muscles. a. Quelles protéines sont mises en jeu et dans quel compartiment de l’organisme ? b. Comment expliquez le transfert d’O2 des poumons vers les muscles ? c. Selon les différentes classifications des protéines, comment ces protéines seront-elles

définies ? d. Les acides aminés de ces protéines sont-ils mis directement en jeu pour fixer l’O2 ? Justifier e. Du CO dégagé par un poêle mal réglé peut vous asphyxier en privant toutes vos cellules de

l’apport d’O2 Pourquoi ?

3.2 Mécanisme de fixation de O2

a. A saturation, la myoglobine fixe 1 molécule d’O2 alors que l’hémoglobine (Hb) fixe 4 molécules d’O2. En quoi ces 2 protéines ont-elles une structure différente ? Décrivez-les.

b. La constante d’affinité de l’Hb pour la 1ère molécule d'O2 est plus faible que la constante d’affinité pour la seconde molécule d’O2, elle même plus faible pour la 3ème etc.... • Comment nomme-t-on ce phénomène ? • Comment l’explique-t-on au niveau moléculaire ?

c. En altitude il y a adaptation de l’organisme par diminution de l’affinité de Hb pour le dioxygène en quelques jours Pourquoi ?

3.3 Hémoglobine

a. Pourquoi les chaînes α et β de l’hémoglobine sont-elles capables de s’associer alors que les chaînes de myoglobine ne le font pas ?

b. A haute altitude, la concentration en DPG (2,3-diphospho glycérate) augmente de 50% (après 2 jours à 4000 m). Pourquoi ?

c. Par quel mécanisme l’oxyhémoglobine est elle capable de libérer plus de dioxygène dans les tissus à métabolisme rapide ?

3.4 Comparaison de l’hémoglobine fœtale et maternelle.

a. Soient les courbes ci-contre de saturation en O2 de l’hémoglobine fœtale et maternelle.

Dans les conditions physiologiques, quelle est l’hémoglobine qui a la plus forte affinité pour O2 ?

b. Quelle est la signification physiologique de ces différences d’affinité pour l’O2?

c. Quand on supprime tout le 2,3 diphosphoglycérate (DPG) lié, les courbes se déplacent vers la gauche, supprimant la différence entre les 2 hémoglobines.

• Quel est l’effet du DPG sur l’affinité des Hb pour l’O2 ?

• Comment expliquer l’effet plus important sur l’HbA ?

3.5 La migration d'un anticorps monoclonal (issu du même clone de plasmocytes) en électrophorèse sur gel de polyacrylamide conduit à une seule bande. Après traitement par le β-mercaptoéthanol, 2 bandes apparaissent

• Quelle caractéristique structurale de ces anticorps est ainsi mise en évidence?

Page 13: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 13

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

• Ces anticorps sont digérés par la papaïne et génèrent 2 types de fragments. Quelles sont les fonctions respectives de ces 2 types de fragments?

• Faire un schéma de la structure complète d'une immunoglobuline. 3.6 Contraction musculaire

a. Dans une fibre musculaire lors de la contraction, identifier sur le schéma ci-contre les protéines qui participent à ce mécanisme.

• préciser la nature de ces interactions entre ces protéines. • classer ces protéines en protéines structurales et en protéines de régulation.

Justifier votre réponse en décrivant brièvement le rôle de ces protéines.

3.7 Régulation de la contraction musculaire. Après un accident de ski, un patient suit une rééducation comprenant des séances de

stimulation musculaire électrique externe : des électrodes parcourues par des pulsions régulières de courant très faible sont placées sur un muscle, ce qui conduit à des contractions musculaires successives.

a. Sur le schéma suivant, qui représente un ……………………………. , remplir les cases blanches :

b. Proposer une hypothèse très simple pour expliquer l’effet de cette stimulation musculaire électrique externe sur la contraction musculaire.

c. Quelles protéines interagissent directement lors du raccourcissement du sarcomère ? Quel est le rôle de l’ATP dans ce phénomène ?

d. La myasthénie est une maladie neuromusculaire chronique liée à un défaut de transmission entre le nerf et le muscle. La faiblesse musculaire augmente à l'effort et peut

Page 14: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 14

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

aboutir à une paralysie partielle du muscle concerné. Le repos améliore la force musculaire. - La myasthénie est-elle une maladie auto-immune ? Pourquoi ? - Quelles sont les conséquences de cette pathologie sur la stimulation répétitive d’un

nerf moteur ? - Quels anticorps faut-il rechercher pour en faire le diagnostic ?

4. ENZYMOLOGIE

4.1 Généralités 4.1.1 Caractéristiques des enzymes.

• Quelle est la fonction d’un enzyme ? • Quelle partie d'un enzyme est responsable de son activité ? de sa spécificité ? de son

action de catalyseur? Expliquer. • Décrire les effets de la température ; de l’urée ; du β-mercaptoéthanol ; des pH

extrêmes sur l’activité d’un enzyme. 4.1.2 L’absorption de la lumière (quantifiée par la densité optique ou DO) par un composé

chromogène est proportionnelle à sa concentration et est maximale pour une longueur d’onde propre à ce chromogène.

λ (nm) DO (NAD+) DO (NADH)

220 0,150 0,160 260 0,840 0,850 300 0,160 0,150 340 0 0,860

Pour déterminer les spectres d’absorption de deux chromogènes, le NAD+ et le NADH, on mesure leur DO à différentes longueurs d’onde, à l’aide d’un spectrophotomètre. Les résultats sont reportés dans le tableau ci-contre. 380 0 0,14

Tracer dans la zone quadrillée ci-contre les spectres d’absorption du NAD+ et du NADH. En déduire les longueurs d’onde maximales d’absorption du NAD+ et du NDAH. Sachant que la lactate déshydrogénase catalyse la réaction :

Pyruvate + NADH + H+ Lactate + NAD+ Proposer, compte tenu de ces résultats, une méthode de suivi de cette réaction.

4.1.3 Interprétez les différents

effets immédiats du pH sur l’activité des 3 enzymes suivantes : papaïne, pepsine et trypsine :

4 6 8

Activ

ité e

nzym

atiq

ue

100 %PAPAÏNE

2 4 6

100 %PEPSINE

6 8 10

100 %TRYPSINE

pH pH pH

Page 15: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 15

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

4.1.4 Qu'appelle-t-on protéolyse ménagée ?

Donner un exemple en donnant les substrats et produits de la réaction : a. d'un enzyme pancréatique, b. d'une hormone peptidique

4.2 Enzyme Michaëlien 4.2.1 Décrire et préciser la fonction des étapes essentielles d'une réaction enzymatique

michaëlienne. 4.2.2 On veut déterminer la vitesse initiale d’une réaction enzymatique. On utilise une mesure

potentiométrique pour suivre le déroulement de la réaction en mesurant la quantité de substrat transformé en fonction du temps. On a les données suivantes:

Temps (minutes)

Quantité de substrat transformé (nmoles)

0 0 1 29,6 2 59,2 3 88,8 5 111

10 170

• Quel est le temps le plus long où il est possible de déterminer la vitesse initiale?

• Quelle en sera la valeur?

20 226 4.2.3 On étudie la variation de la vitesse d'une réaction en fonction de la concentration x d'enzyme. Tracer sur le même graphique :

a. La courbe obtenue en présence d'une concentration 2x d'enzyme.

b. La courbe obtenue en présence d'une même concentration x d'un enzyme qui aurait plus d'affinité pour le substrat.

c. La courbe obtenue lorsque la réaction est effectuée à pH 1 à chaud (70°C).

4.2.4 La constante de Michaelis de l’hexokinase pour le glucose est

de 0,15 mM tandis quelle est de 1,5 mM pour le fructose avec des vitesse maximales pratiquement égales. a. Calculer pour chacun des deux oses les vitesses de réactions , exprimées en

pourcentage de la vitesse maximale Vm, pour des concentrations initiales (c.a.d au temps 0) de substrats égales à 0,15mM et 1,5mM.

b. Lequel de ces deux oses présente l’affinité la plus grande pour l’hexokinase? c. Dessiner (en choisissant arbitrairement la vitesse maximale) les droites de Lineweaver-

Burke correspondant à chacun des deux oses. 4.2.5 L'addition d'un composé X dans une réaction enzymatique entraîne des modifications

cinétiques responsables d'un déplacement de la courbe Vi = f(S ) selon le profil ci-dessous (la flèche indique l'effet obtenu sous l'action de concentrations croissantes du composé X) Quelle est parmi les courbes présentées ci-dessous (représentation de Lineweaver-Burk) celle qui correspond à cette situation? Justifier votre réponse.

S

Page 16: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 16

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

4.2.6 Supposons que la concentration en 1 composant X soit d'environ 10-4M. Supposons que soient présents un enzyme A qui a pour ce composé un Km = 10-3 M et un

enzyme B qui a pour ce même composé un Km cent fois plus petit (10-5 M). a. Dans ces conditions par quel enzyme doit-on s'attendre à ce que le composé X soit

modifié essentiellement ? b. Une multiplication par 10 de la concentration en composé X accélérerait-elle de

façon appréciable son attaque par l'enzyme B ? c. Justifiez vos réponses par une brève explication. 4.2.7 La succino-déshydrogénase catalyse la réaction : -OOC-CH2-CH2-COO- + FAD -OOC-CH=CH-COO- + FADH2

succinate fumarate Pour étudier cette enzyme, on incube, à concentration constante d’enzyme, différentes concentrations de succinate et on mesure les vitesses initiales (exprimées en fumarate formé par unité de temps) en absence puis en présence de 2 effecteurs X1 et X2. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant :

Succinate Vo ( µmol/l/min de fumarate) mmol/l sans effecteur effecteur X1 effecteur X2

1 3,3 1,75 2,0 2 5,0 3,00 3,0 4 6,6 4,50 4,0 8 8,0 6,30 4,5

a. Déterminer graphiquement la valeur de Km et de Vmax en absence d’effecteur. b. Sur le même graphique, tracer les résultats obtenus avec les effecteurs X1 et X2.

De quel type d’effecteurs s’agit-il ? c. Sachant que l’un des 2 effecteurs ajoutés est le malonate (qui diffère du succinate par

un groupement CH2 : -OOC-CH2-COO- ), indiquer lequel des 2 effecteurs X1 ou X2 peut correspondre au malonate.

4.2.8 Soit le diagramme ci-contre (incomplet) d'une cinétique

enzymatique : a. Compléter la figure en indiquant les unités et les

principaux paramètres des cinétiques I et II. (choisir une ordre de grandeur possible pour les unités)

b. On passe de I à la cinétique II en ajoutant 4 picomoles (10-

12 mole) de produit X à la solution enzymatique. • De quel type d'inhibition s'agit-il ?

Page 17: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 17

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

4.3 Enzyme Allostérique

4.3.1 La phosphofructokinase (PFK) catalyse la réaction :

Fructose 6P + ATP ➔ Fructose 1-6 diP + ADP

L'activité de la PFK varie en fonction de la concentration en fructose 6P et en ATP de la manière suivante :

• Quelle est la régulation par le fructose-6P pour une concentration donnée d'ATP?

• Quel paramètre permet de caractériser la variation d'activité en fonction de la concentration en ATP?

• Quelles sont les 2 rôles de l'ATP pour la PFK ?

4.3.2 Un chercheur étudie une enzyme qui possède 4 sous-unités et se comporte de façon

michaélienne vis-à-vis de son substrat. Il fait l’hypothèse qu’il pourrait s’agir d’une enzyme allostérique appartenant au système V.

a. Quelle sera l’allure de la courbe de saturation de cette enzyme : • par un activateur allostérique ? • par un inhibiteur allostérique ?

b. Quelle sera l’allure de la courbe de saturation par le substrat : • en présence d’activateur ? • en présence d’ inhibiteur ?

4.3.3 Soient trois enzymes différents E1, E2 et E3 , qui sont activables dans certaines

conditions : a. l’activation de E1 s’accompagne d’un changement de configuration quaternaire, sans

changement de poids moléculaire ; b. l’activation de E2 s’accompagne d’une diminution de poids moléculaire de l’enzyme; c. l’activation de E3 est contrariée par l’addition d’une phosphatase .

• Indiquer les modèles d’activation rendant compte de chacune de ces trois situations.

• Donner un exemple de chacun des modèles.

5. Problèmes de révision

5.1 On se propose d'étudier deux protéines A et B dont l'importance biologique a été soulignée dans le cours de biochimie des protéines. On a produit une protéine A particulière capable d'interagir avec la protéine B. Pour étudier ces deux protéines on utilise une approche classique qui consiste soit à digérer chacune des protéines d'intérêt par une ou plusieurs enzymes dont les spécificités de clivage sont connues, soit à appliquer des traitements physiques ou chimiques. 5.1.1 Étude de la protéine A - La protéine A est tout d'abord traitée par du β-mercaptoéthanol (β-ME) puis soumise à une électrophorèse monodimensionnelle en présence de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Le résultat de l'électrophorèse est schématisé sur la figure 1A.

Enzyme 1 sans sans sans avec avec

β -ME sans avec sans sans avec

kDa

150

50

25

Pistes 1 2 1 2 3

Figure 1A Figure 1B

Page 18: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 18

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

- La protéine A est également traitée (de manière indépendante à l'expérience précédente) par une enzyme E1. Le produit de la digestion enzymatique est également analysé par électrophorèse mono-dimensionnelle en SDS. Cette analyse est effectuée dans deux conditions : soit le produit de la digestion enzymatique est analysé directement, soit ce produit est traité par du β-ME avant d'être analysé. Les résultats de cette expérience sont schématisés sur la figure 1B. ATTENTION : (1) la présence d'une bande à un poids moléculaire donné signifie qu'au moins un polypeptide de cette masse est présent. (2) la masse totale de la protéine est égale à la somme des masses de ses constituants.

a. A quoi sert le β-ME ? b. Quel est l'acide aminé susceptible de générer une liaison chimique sensible au β-ME ? c. Comment s'appelle la molécule résultant de la formation de cette liaison chimique

sensible au β-ME ? d. Interprétez brièvement le résultat de la figure 1A e. Interprétez brièvement le résultat de la figure 1B. f. En fonction de ces résultats et de vos connaissances de cours, donnez le nom de la famille

à laquelle appartient la protéine A. 5.1.2. Étude de la protéine B. La protéine B est une protéine multimérique. On ne considère ici que l'une des sous unités de grande taille. Ce monomère est traité par deux enzymes E1 (la même que celle utilisée pour l'étude de la protéine A) et E2. Plusieurs protocoles expérimentaux sont réalisés dans lesquels soit E1, soit E2, soit les 2 enzymes E1 et E2 sont utilisés (d'abord E2 puis E1). Le produit de la ou des digestion(s) enzymatique(s) est analysé par électrophorèse monodimensionnelle en SDS. Les résultats sont schématisés sur la figure 2.

a. Expliquer brièvement le résultat obtenu sur la piste 1 b. Expliquer brièvement le résultat obtenu sur la piste 2 c. Expliquer brièvement le résultat obtenu sur la piste 3 d. Expliquer brièvement le résultat obtenu sur la piste 4 e. En fonction de ces résultats et de vos connaissances

de cours donnez le nom de la protéine B. f. Quel est le nom de l'enzyme E1 ? g. Quel est le nom de l'enzyme E2 ?

5.1.3. Étude fonctionnelle des protéines A et B. La bande de 50 kDa correspondant à la protéine A digérée par l'enzyme 1 (figure 1B, piste 2) est excisée du gel et les fragments protéiques contenus dans cette bande sont purifiés et analysés. On obtient 2 fragments différents f1 et f2. On réalise alors deux colonnes de chromatographie d'affinité contenant des billes sur lesquelles on fixe soit f1 (colonne n°1) soit f2 (colonne n°2). Ces deux colonnes sont ensuite utilisées pour analyser les fragments obtenus par la double digestion enzymatique de la protéine B (figure 2, piste 4). Les résultats obtenus sont schématisés sur les graphiques de la figure 3 dans lesquels l'axe des ordonnées représente les quantités de protéines éluées de la colonne de chromatographie. a. Que conclure de l'expérience de la figure 3 sur la fonction du fragment f1 de la protéine A ? Les protéines contenues dans les pics 1, 2 et 1' sont ensuite étudiées dans une réaction enzymatique dans laquelle on mesure la capacité de ces protéines à réaliser la transformation suivante : ATP (marqué au 32P) ADP + 32P (libre). Pour mesurer cette transformation il est

Enzyme 1 sans avec sans avec

Enzyme 2 sans sans avec avec

kDa

220

143 122

77

21

Pistes 1 2 3 4

Figure 2

Chromatographie d’affinité colonne 1 :

fragment f1 de A colonne 2 :

fragment f2 de A

Figure 3

Élution spécifique

1 2 1’

Élution spécifique

Page 19: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 19

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

possible de quantifier la radioactivité (coups par minute ou "cpm") associée avec le 32P libre. La même quantité de protéine est ajoutée dans chaque expérience. Les résultats sont représentés dans le tableau suivant :

Protéines provenant du pic cpm de départ cpm dans le 32P libre

Pas de protéine (contrôle) 10 000 100 1 10 000 103 2 10 000 7954

b. Que conclure sur la fonction de la protéine contenue dans le pic 2 de la protéine B ? c. Compte tenu de ces résultats et de vos connaissances, quel est le nom donné aux fragments f1 et f2 de la protéine A ? 1' 10 000 8012

d. Compte tenu de ces résultats et de vos connaissances, quel est le nom de la molécule isolée dans le pic 2 ?

e. Comment expliquer la présence de radioactivité dans le pic 1’ ?

5.2 On s’intéresse à une enzyme E, ubiquitaire. dont on souhaite préciser les principales

caractéristiques biochimiques. 5.2.1 On utilise comme source biologique du tissu musculaire obtenu par biopsie. Dans un

premier temps l’échantillon est broyé et l’on obtient un lysat cellulaire. a. Ce lysat est centrifugé à basse vitesse (1000xg). Le surnageant de cette première

centrifugation est à nouveau centrifugé à 20000xg. Que contient le culot de cette seconde centrifugation ?

b. On veut savoir si au moins l’un des organites ci-dessus contient l’enzyme E. Pour cela, on dispose d’une méthode de mesure de l’activité enzymatique dans laquelle la fraction résultant de la centrifugation à moyenne vitesse est mélangée avec un substrat. Les résultats des mesures sont représentés dans les 3 graphiques ci-dessous :

Quelle est l’information apportée par chaque graphique ?

c. Compte tenu de l’ensemble de vos connaissances et des données expérimentales, quel est, à

votre avis, l’organite qui contient l’enzyme E ?

d. Comment s’appelle la méthode utilisée pour la mesure de l’activité enzymatique ? 5.2.2. On réalise la même expérience que celle réalisée dans le graphique B ci-dessus en

changeant quelques conditions : a. on diminue de moitié la quantité d’enzyme E. b. on réalise l’incubation après avoir chauffé le lysat cellulaire à 100°C pendant 30 minutes. c. on réalise l’incubation en présence d’un inhibiteur compétitif.

Quantité de lysat(ml)

1 2 3 4 5 6 7

1

2

3

4

5

6

7

Concentration du substrat(µM)

5 10 15 20 25 30 35

pH

2 3 4 5 6 7 8

B CA

Page 20: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 20

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

Représenter les résultats obtenus dans les 3 conditions sur les graphiques suivants : condition 2.1 condition 2.2 condition 2.3

NB : la courbe obtenue dans le graphique B a été reproduite pour servir de comparaison. 5.2.3. On veut isoler la protéine responsable de cette activité enzymatique. Dans ce but on réalise une analyse biochimique de la fraction résultant de la centrifugation à moyenne vitesse. Le résultat est présenté dans la figure ci-contre : a. Comment s’appelle cette analyse ? b. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens horizontal ? c. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens vertical ?

d. On découpe les spots notés de « a » à « g » et

l’on mesure l’activité enzymatique spécifique de ces spots. Les résultats sont présentés sur le graphique suivant :

• D’après ces résultats, quel est le spot qui contient l’enzyme E ?

• Comment expliquer les résultats observés pour le spot d ?

5.2.4. Pour vérifier l’hypothèse formulée ci-dessus

pour le spot « d », on réalise une expérience dans laquelle, la protéine contenue dans le spot « d » est soumise à plusieurs traitements dans des conditions standard de mesure de l’activité enzymatique :

Traitement Résultat mesure de l’activité à pH 8 baisse d’activité incubation préalable avec une enzyme protéolytique forte augmentation d’activité incubation préalable avec de l’aspirine aucun effet

Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ?

20

Concentration du substrat(µM)

5 10 15 25 30 35

Concentration du substrat(µM)

5 10 15 20 25 30 35

Concentration du substrat(µM)

205 10 15 25 30 35

actine

pH3 pH10

ab c

d

ef

g

a b c

e d

f

g

Page 21: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 21

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

6. ANNALES DU CONCOURS QCM 2005

1. Parmi les propositions suivantes concernant les liaisons hydrogène, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s):

a. Ce sont des liaisons covalentes de faible énergie b. Interviennent dans les interactions entre

molécules d’eau c. Interviennent dans les interactions entre sous-

unités au sein d’une protéine oligomérique d. Interviennent dans la stabilisation des hélices α

aussi bien que des feuillets β e. Interviennent dans les interactions entre

antigène et anticorps

2. Parmi les propositions suivantes concernant la séquence peptidique gly-val-cys-gly-ser-lys-lys-arg-pro-cys-thr-gly indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Les prédictions bioinforma-tiques suggèrent une forte probabilité d’hélice α

b. Elle est basique c. Elle peut contenir un pont disulfure d. Elle absorbe fortement dans l’ultra-violet parce

qu'elle contient des résidus d’acides aminés aromatiques

e. Elle contient des séquences répétitives . 3. Parmi les propositions suivantes concernant la

liaison peptidique indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Est une liaison ester particulière b. A son niveau, les électrons sont distribués sur une

orbitale moléculaire π recouvrant les atomes O, C , N

c. Présente des configurations variables en fonction des chaînes latérales des acides aminés impliqués

d. Les configurations CIS et TRANS sont déterminées par l’angle de torsion autour de la liaison C-N

e. Ce sont les valeurs des angles Φ et ψ qui déterminent la conformation spatiale de la chaîne polypeptidique

4. Parmi les propositions suivantes concernant

les feuillets β indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Ils sont stabilisés par des liaisons hydrogène b. Ils sont associés à des valeurs particulières des

angles Φ et Ψ Ils participent à la constitution des motifs

immunoglobuliniques d. Leur présence dans la structure d’une protéine est

incompatible avec la présence d’hélices α e. Les feuillets β parallèles sont plus stables que les

feuillets β anti-parallèles

5. Parmi les propositions suivantes concernant la proline indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Sa chaîne latérale contient une fonction alcool b. Sa chaîne latérale est liée à la fois au carbone α

et à l’azote c. C’est un acide aminé apolaire à chaîne

aromatique d. C’est un résidu à l’origine de coudes dans la

structure des protéines

e. Elle est impliquée dans les séquences répétitives de la myosine

6. Parmi les propositions suivantes concernant la

fixation de l’oxygène sur l’hémoglobine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Se fait sur la chaîne latérale d’un résidu d’histidine

b. Induit le déplacement de l’atome de fer par rapport au plan de l’hème

c. Se fait avec une plus grande affinité sur l’état relâché (R) que sur l’état tendu (T)

d. Est facilitée par la présence de 2,3 diphospho-glycérate

e. Est très fortement diminuée par la présence de monoxyde de carbone à la même pression partielle que l’oxygène

7. Parmi les propositions suivantes concernant

les mécanismes moléculaires de la contraction musculaire, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s):

a. La contraction est sélectivement déclenchée par une diminution de la concentration intracellulaire en ions calcium

b. En l'absence de calcium, la troponine et la tropomyosine empêchent la fixation de la myosine sur l’actine

c. Le site de liaison de l’actine est localisé sur la queue de la myosine

d. C’est l’hydrolyse de l’ATP au niveau de la tête de la myosine qui permet la fixation de la myosine sur l’actine

e. L’hydrolyse de l’ATP entraîne un changement conformationnel au niveau de la tête de la myosine

8. Parmi les affirmations suivantes concernant

toute protéine enzymatique, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle agit à faible concentration b. Son action nécessite la présence d’un cofacteur c. Elle est inchangée à la fin de la réaction qu’elle

catalyse d. Elle n’affecte pas l’équilibre d’une réaction

réversible e. Elle n’affecte pas la vitesse à laquelle cet

équilibre est atteint

9. Parmi les propriétés suivantes indiquer celle(s) qui est (sont) attribuables à l’aspirine (acide acétylsalicylique) : a. Est un inhibiteur enzymatique irréversible b. Est un inhibiteur enzymatique réversible c. A des propriétés anti-infectieuses d. Est un inhibiteur des cyclo-oxygénases (COX) e. Est un inhibiteur des phosphodiestérases

10. Parmi les propriétés suivantes indiquer celle(s) qui est (sont) attribuables à un anti-inflammatoire non-stéroïdien (AINS) autre que l’aspirine : a. Est un inhibiteur enzymatique irréversible b. Est un inhibiteur enzymatique réversible c. A des propriétés anti-infectieuses d. Est un inhibiteur des cyclo-oxygénases (COX) e. Est un inhibiteur des phosphodiestérases

Page 22: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 22

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

11. Parmi les propriétés suivantes indiquer celle(s) qui n’est (sont) attribuables à aucun des AINS, aspirine comprise : a. Est un inhibiteur enzymatique irréversible b. Est un inhibiteur enzymatique réversible c. A des propriétés anti-infectieuses d. Est un inhibiteur des cyclo-oxygénases (COX) e. Est un inhibiteur des phosphodiestérases

QCM 2006

1. Parmi les propositions suivantes concernant les molécules d’eau, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elles sont apolaires b. Elles forment des liaisons hydrogène entre elles c. Les deux atomes d’hydrogène constituent la

région électronégative d. Elles ne sont pas ionisables, même en présence

d’un acide fort e. Elles peuvent interagir avec les protéines par des

liaisons hydrogène.

2. Parmi les propositions suivantes concernant la molécule de myoglobine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle contient des hélices alpha b. Elle présente une structure fibrillaire c. Elle contient 4 atomes de fer d. C’est une protéine monomérique e. Le domaine qui contient l’hème est constitué de

feuillets béta. 3. Parmi les propositions suivantes concernant

l’hème de la myoglobine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Il est formé de cinq noyaux pyrrole b. Chaque noyau pyrrole contient un atome d’azote c. L’ion ferreux dispose de six liaisons de

coordination d. Lorsque l’atome de fer est sous forme ferreuse il

peut fixer un ion Ca++

e. L’hème est une structure plane.

4. Parmi les propositions suivantes concernant la molécule d’hémoglobine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Contient 4 atomes de fer b. Est constituée de 4 sous-unités : 2 sous-unités

alpah, 1 sous-unité béta et 1 sous-unité gamma c. Les sous-unités alpha et béta sont liées par des

ponts disulfure d. F fixe 4 molécules de DPG e. Fixe le DPG uniquement dans l’état « tendu » T. 5. Parmi les propositions suivantes concernant les

conditions qui facilitent la fixation de l’oxygène sur la molécule d’hémoglobine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. L’augmentation de la pression partielle en O2 b. L’augmentation de la pression partielle en CO2 c. L’augmentation de la pression partielle en CO d. L’augmentation du pH e. L’augmentation de la concentration en DPG.

6. Parmi les propositions suivantes concernant la drépanocytose, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle est caractérisée par l’existence d’une mutation ponctuelle dans la séquence de la chaîne béta de l’hémoglobine

b. Elle est caractérisée par l’absence de sous-unité alpha

c. La fixation de l’oxygène sur l’hémoglobine anormale HbS est fortement altérée

e. La conformation de la désoxyhémoglobine S est anormale

d. Les hématies falciformes contiennent des polymères de désoxyhémoglobine S.

7. Parmi les propositions suivantes concernant le

site de liaison de l’antigène dans une molécule d’Immunoglobuline G, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Il est constitué par l’association de 3 boucles hypervariables

b. Il est constitué par l’association de 6 boucles hypervariables appartenant aux domaines variables des chaînes lourdes

c. Il est porté par le fragment Fc d. Il y a 2 sites de liaison par molécule d’IgG e. Il est détruit par l’action de la papaïne.

8. Parmi les propositions suivantes concernant

l’actine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Les filaments d’actine constituent les filaments fins du sarcomère

b. L’actine G est une protéine fibrillaire c. Au moment de la contraction, la zone de

filaments fins se raccourcit d. L’actine G possède une activité ATPasique

indispensable à la contraction musculaire e. Possède un site de liaison pour la tropomyosine

9. Parmi les propositions suivantes concernant le

fragment S1 (tête de la myosine), indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Il est obtenu par dissociation de la molécule de myosine en sous-unités à l’aide de SDS

b. Il est obtenu par clivage protéolytique de la myosine par la trypsine et la papaïne

c. Il est constitué par l’association des deux chaînes légères de la myosine alors que les chaînes lourdes forment la queue de la myosine

d. Il possède un site de liaison qui peut fixer de façon compétitive l’actine et l’ATP

e. L’addition d’ion Ca++ induit un changement conformationnel du fragment S1 isolé.

10. Parmi les propositions suivantes concernant la

régulation par les ions Ca++ de la contraction musculaire, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. L’augmentation en Ca++ cytoplasmique qui déclenche la contraction musculaire est du à une entrée massive de Ca++ dans la cellule à partir du milieu extracellulaire

b. Les ions Ca++ se fixent sur la troponine c. La fixation de Ca++ sur la troponine provoque le

déplacement de la tropomyosine sur l’actine d. Les ions Ca++ activent directement l’activité

ATPasique de la myosine et déclenchent ainsi la contraction musculaire

Page 23: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 23

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

e. Après le déclenchement de la contraction, la concentration cytoplasmique en Ca++ diminue du fait de l’activité de la calcium-ATPase du reticulum sarcoplasmique.

11. Parmi les propositions suivantes concernant le

récepteur nicotinique de l’acetylcholine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. C’est une protéine intégrale de la membrane b. Certaines régions de sa surface ont un caractère

hydrophobe c. C’est un canal ionique dont l’ouverture est régulée

par les variations du potentiel membranaire d. Il contient 20 hélices transmembranaires qui

constituent le pore e. La sélectivité ionique est en partie liée à

l’existence de charges positives portées par des résidus d’acides aminés formant la paroi interne du pore.

12. Parmi les propositions suivantes concernant

l’hélice alpha, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Les chaînes latérales sont à l’extérieur de l’hélice b. Elle est stabilisée par des liaisons hydrogène c. Elle est caractérisée par des valeurs précises des

angles phi et psi d. La proline est l’un des acides aminés les plus

fréquents dans les hélices alpha e. C'est la structure secondaire de base des

domaines constants des immunoglobulines G.

13. Parmi les propositions suivantes concernant la lysine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Sa chaîne latérale porte une fonction acide b. Présente en solution aqueuse une charge globale

positive à pH 7 c. Présente en solution aqueuse une charge globale

nulle à pH 1 d. Contient deux fonctions NH3

+ en solution aqueuse à pH 7

e. Lorsqu’elle est insérée dans un peptide, la lysine a une chaîne latérale neutre à pH7.

14. Parmi les propositions suivantes concernant la

glycine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. Possède un carbone asymétrique b. A une chaîne latérale constituée d’un méthyle CH3 c. A une charge globale voisine de 0 en solution

aqueuse à pH7 d. Est l’acide aminé le plus fréquent dans les coudes

béta e. Sa présence en quantité importante dans une

séquence peptidique permet de prédire une forte probabilité d’hélice alpha.

15. Parmi les propositions suivantes, indiquez

celle(s) qui peut (peuvent) s’appliquer à un cofacteur enzymatique :

a. Transporte un substrat de la réaction enzymatique b. Complémente un substrat de la réaction

enzymatique c. Accepte un produit de la réaction enzymatique d. Participe à la structure d’un enzyme e. Régule l’activité d’un enzyme

16. Parmi les propositions suivantes, indiquez

celle(s) qui est (sont) vraie(s) : a. La constante de Michaelis (Km) est égale à la

concentration de substrat à laquelle la vitesse d’une

réaction enzymatique est égale à la moitié de la vitesse maximale (Vmax)

b. Km est un index de l’affinité d’un enzyme pour son substrat

c. La Vmax d’une réaction enzymatique est une constante caractéristique d’un enzyme donné

d. Dans la représentation de Lineweaver et Burk (graphe en double inverse), l’ordonnée à l’origine est égale à la Vmax

e. Dans le cas d’un enzyme allostérique, quelles que soient les conditions expérimentales, l’expression de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration de substrat est représentée par une courbe sigmoïde

QCM 2007

1. Dans une colonne de chromatographie par

échange d’ions dont la phase fixe est composée de billes chargées négativement, indiquer les protéines qui sortent dans les toutes premières fractions :

a. Celles qui ont le pI le plus faible b. Celles qui ont le pI le plus élevé c. Celles dont le pI est inférieur au pH de la

solution d’élution c. Celles dont la masse moléculaire est la plus

élevée d. Celles dont la masse moléculaire est la plus

faible

2. On purifie une protéine que l’on analyse en électrophorèse PAGE. Sans traitement par le βmercaptoéthanol on obtient une seule bande de 120 kDa et après traitement par le βmercaptoéthanol on obtient une seule bande de 60 kDa. Sachant que la protéine native a une masse moléculaire totale de 240 kDa, indiquer parmi les propositions suivantes concernant la composition en sous-unités, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Deux sous-unités de 120 kDa associées par des ponts disulfure

b. Deux sous-unités de 60 kDa associées par des ponts disulfure et une de 120 kDa non associée par des ponts disulfure

c. Quatre sous-unités de 60 kDa d. Une sous-unité de 120 kDa associée par des

ponts disulfure à une sous-unité de 60 kDa et une deuxième sous-unité de 60 kDa non associée par des ponts disulfure

e. Trois sous-unités, une de 120 kDa et deux de 60 kDa.

3. Parmi les propositions suivantes concernant les

liaisons hydrogène, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s):

a. Elles sont responsables des propriétés cohésives de l’eau

b. Dans les protéines il n’en existe qu’un seul type, entre l’hydrogène de la fonction carboxyle et l’azote de la fonction amine

c. Elles sont détruites lors de la dénaturation des protéines

d. Elles sont responsables de la stabilisation des hélices α mais non des feuillets β

e. Elles interviennent dans les interactions entre sous-unités au sein d’une protéine oligomérique.

Page 24: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 24

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

4. Parmi les propositions suivantes concernant l'histidine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s):

a. C’est un acide aminé à chaîne latérale aromatique b. A une chaîne latérale chargée positivement à pH

7,0 (pK=6,0) c. Sa chaîne latérale est dirigée vers l’extérieur de

l’hélice α d. Intervient indirectement dans la fixation de la

molécule d’oxygène sur la myoglobine e. Contient un cycle dans sa chaîne latérale 5. Parmi les propositions suivantes concernant la

tyrosine, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s): a. C’est un acide aminé à chaîne latérale aromatique b. Contient un noyau indol dans sa chaîne latérale c. Est neutre en solution aqueuse à pH7 d. Absorbe la lumière ultra-violette e. La tyrosine est un résidu qui intervient dans la

régulation de l’activité de nombreuses protéines

6. Les protéine-kinases catalysent les réactions de phosphorylation c'est-à-dire la fixation d’un résidu phosphate. Indiquer sur quel(s) résidu(s) d’acide aminé cette fixation peut se faire :

a. Méthionine b. Tyrosine c. Tryptophane d. Thréonine e. Sérine 7. Indiquer, parmi les propositions suivantes

concernant les feuillets β , celle(s) qui est (sont) exacte(s)

a. Les valeurs des angles Ω dans un feuillet β diffèrent de celles des angles Ω dans une hélice α

b. Les feuillets β antiparallèles sont plus stables que les feuillets β parallèles

c. Les feuillets β sont stabilisés par des liaisons hydrophobes

d. Le motif immunoglobulinémique est majoritairement constitué de feuillets β

e. Les feuillets β antiparallèles sont caractérisés par des valeurs spécifiques des angles Ψ et Φ

8. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant la myoglobine celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle contient un pourcentage important d’hélices α b. C’est un mauvais transporteur parce que son

affinité pour l’O2 est trop faible c. Elle possède comme l’hémoglobine un site de

liaison pour le 2,3diphospho-glycérate d. La fixation de la molécule d’O2 met en jeu un

résidu de tryptophane e La fixation de la molécule d’O2 ne peut se faire que

sur le fer sous sa forme ferrique (Fe3+) 9. Indiquer, parmi les propositions suivantes

concernant l’immunoglobuline G, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. C’est un tétramère b. L’analyse en électrophorèse PAGE après

réduction par le β-mercaptoéthanol révèle 2 bandes protéiques de 25 et 50 kDa

c. Chaque chaîne légère est associée à une autre chaîne légère par des ponts disulfure intercaténaires

d. Est dissociée en chaînes légères et en chaînes lourdes par la papaïne

e. Le fragment Fc représente le domaine de reconnaissance de l’antigène

10. Indiquer, parmi les propositions suivantes

concernant l’actine G monomérique, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. C’est une protéine fibrillaire b. C’est le constituant majoritaire des filaments

épais au sein d’un sarcomère c. C’est une protéine essentiellement constituée de

feuillets β d. Interagit spécifiquement et directement avec la

tête de la myosine e. Interagit spécifiquement et directement avec la

tropomyosine

11. Indiquer, parmi les propositions suivantes concernant la contraction musculaire, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle déclenchée par l’augmentation de la concentration en ion Ca++ cytoplasmique dans le myocyte

b. Le calcium déclenche la contraction en se fixant sur un site spécifique sur la molécule d’actine

c. Le calcium en se fixant sur la tête de la myosine induit un changement de conformation de la molécule de myosine

d. L’augmentation de la concentration en ion Ca++ cytoplasmique déclenche le clivage d’une molécule d’ATP au niveau de la tropomyosine

e. Le calcium qui déclenche la contraction provient du réticulum endoplasmique.

12. Indiquer, parmi les propositions suivantes

concernant le récepteur nicotinique, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. C’est un pentamère b. C’est une protéine intégrale de la membrane c. Une analyse par électrophorèse PAGE après

réduction par le β mercaptoéthanol révèle un ensemble de bandes protéiques d’environ 10 kDa correspondant aux hélices intra-membranaires

d. La fixation de l’acétylcholine induit la fermeture du pore

e. La fixation de l’acétylcholine induit une rotation des hélices M2

13. Parmi les propositions suivantes concernant

les protéines enzymatiques, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. elles agissent à forte concentration b. elles sont détruites au cours de la réaction

qu’elles catalysent c. elles n’affectent pas l’équilibre d’une réaction

réversible d. elles augmentent la vitesse d’une réaction e. elles catalysent une réaction chimique donnée à

partir d’un ou plusieurs substrats définis 14. Parmi les propositions suivantes concernant

les protéines enzymatiques michaeliennes, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. un inhibiteur compétitif provoque une diminution de l’affinité apparente d’un enzyme pour son substrat

b. la formation d’un complexe ternaire entre un enzyme, son substrat et un inhibiteur (complexe ESI) se traduit par une diminution de la vitesse maximale (Vmax) de la réaction

Page 25: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 25

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

c. un inhibiteur compétitif se fixe uniquement sur la forme libre (E) d’un enzyme

d. la fixation d’un substrat dans le site actif d’un enzyme est assurée par des liaisons covalentes

e. la constante de Michaelis (Km) est égale à la concentration d’enzyme à laquelle la vitesse d’une réaction est égale à la moitié de la vitesse maximale (Vmax)

QROC 2007 Des globules rouges (hématies) sont isolés à partir de sang de lapin et la fixation de l’oxygène à l’hémoglobine est mesurée à pH 7,2 en fonction de la pression partielle en oxygène. On obtient une courbe de saturation et on mesure une valeur de P50 égale à 26 mmHg. Les hématies sont ensuite homogénéisées et la protéine hémoglobine est isolée et purifiée par différentes chromatographies. On étudie la fixation de l’oxygène sur la protéine purifiée et on observe une modification de la forme de la courbe de saturation sur les hématies intactes. 1. Décrire cette modification 2. Quelle en est la cause ? 3. La P50 est elle modifiée et si oui dans quel sens ? 4. Les hématies intactes sont incubées à pH 7,6 et on

mesure dans cette condition la courbe de saturation pour l’oxygène. Pour une pression partielle en oxygène de 26 mmHg, le taux de saturation est-t-il supérieur ou inférieur à 50% ?

5. A pH 7,2, on ajoute aux hématies du monoxyde de carbone de manière à obtenir une pression partielle en CO de 2,6 mmHg. Quel est dans ces conditions le taux de saturation en oxygène pour une pression partielle en oxygène de 26mmHg.

QCM 2008

1. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant l’électrophorèse bidimensionnelle celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. La première dimension est une électrofocalisation b. L’électrofocalisation se fait en présence de SDS c. Dans l’électrofocalisation, les protéines sont

séparées sur la base de leurs différences de vitesse de migration

d. Deux protéines de même masse moléculaire ne pourront pas être séparées par électrophorèse bidimensionnelle

e. Le taux de structures secondaires intervient dans la séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle

2. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant la charge globale d’une protéine, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle est très majoritairement déterminée par les charges présentes sur les chaînes latérales des résidus d’acides aminés

b. Elle est nulle à un pH égal au pI de la protéine c. Deux protéines qui ont des pI identiques ne

pourront pas être séparées par chromatographie d’échange d’ions

d. Dans l’électrophorèse SDS-PAGE, les protéines migrent d’autant plus vite que leur pI est élevé

e. Si dans une protéine on transforme par voie chimique les acides aspartiques en asparagines, on induit une diminution du pI.

3. On injecte un antigène A à un lapin dont on

recueille le sérum trois semaines après. On se propose de purifier les IgG anti-antigène A produites et pour cela de les séparer des autres protéines du sérum et des IgG non spécifiques ne reconnaissant pas l’antigène A. Indiquer parmi les propositions suivantes la méthode la plus efficace pour purifier ces IgG.

a. Une chromatographie par échange d’ions b. Une électrophorèse bidimensionnelle c. Une chromatographie d’affinité d. Une filtration sur gel e. Une chromatographie par échange d’ions suivie

d’une filtration sur gel.

4. Les IgG anti-antigène A - purifiées dans la question précédente - sont incubées en présence de l’antigène A et les complexes IgG/Antigène A formés sont purifiés, traités par le b-mercaptoethanol puis analysés par électrophorèse SDS PAGE. On obtient trois bandes protéiques de masse molaire 75, 50 et 25 kDa. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant l’antigène A, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. L’antigène A est une protéine b. L’antigène A est une protéine formée de deux

sous-unités de 50 et 25 kDa c. L’antigène A contient au moins une sous-unité

de 75 kDa d. L’antigène A contient une seule sous-unité de 50

kDa e. La nature chimique de l’antigène A ne peut pas

être déterminée par cette expérience

5. Un peptide a la séquence suivante : Gly-Arg-Arg-Val-Trp-Lys-Val-Ser-Ala-Ala

Indiquer parmi les propositions suivantes concernant ce peptide celle qui est (sont) exacte(s) : a. Il présente une charge globale positive à pH 7 b. Il porte une seule charge négative à pH 7 c. Il est phosphorylable par une protéine-kinase d. On peut déterminer sa concentration en solution

par mesure de l’absorption de la lumière ultra-violette

e. Il contient un résidu de glycine à l’extrémité C-terminale

Gly = Glycine, Arg = Arginine, Val = Valine, Trp = Tryptophane, Lys = Lysine, Ser = Serine, Ala = Alanine

6. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant l’acide glutamique celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Il contient cinq atomes de carbone b. Il contient deux atomes d’azote c. Il porte une fonction carboxylique dans sa

chaîne latérale d. Sa charge globale est nulle à pH 7 e. Il peut participer à des liaisons ioniques au sein

d’une molécule de protéine

Page 26: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 26

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

7. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant l’hélice a celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Elle est stabilisée par des liaisons ioniques b. Dans chaque liaison hydrogène impliquée, c’est

un atome d’azote qui est donneur d’hydrogène et un atome d’oxygène qui est accepteur

c. C’est la structure secondaire majoritaire dans la myoglobine

d. C’est l’hélice que l’on trouve dans les segments transmembranaires du récepteur nicotinique

e. Elle contient des taux élevés de proline

8. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant la protéine prion, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. C’est une protéine allostérique b. La protéine prion infectieuse a une séquence en

acide aminé différente de celle de la protéine prion normale

c. La protéine prion infectieuse contient beaucoup plus de feuillets bêta que la protéine prion normale

d. La protéine prion infectieuse est le résultat d’une mutation dans le gène correspondant

e. La conversion de la forme normale en forme infectieuse est facilitée par la forme infectieuse de la protéine

9. La fixation des molécules d’oxygène à leurs sites

de liaison sur la molécule d’hémoglobine induit un certain nombre de modifications au sein de la protéine. Indiquer parmi les propositions de modifications suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. L’atome de fer se déplace par rapport au plan de l’hème

b. La liaison entre l’atome de fer et l’histidine proximale est rompue

c. L’histidine distale fixe un proton d. Le dimère α1β1 se déplace par rapport au dimère

α2β2

e. Le site de liaison pour le 2,3 DPG est fortement modifié

10. On mesure la fixation de l’oxygène sur des

hématies en fonction de la pression partielle en oxygène dans le milieu. Indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. La courbe obtenue est une hyperbole équilatère b. Même pour une pression partielle en oxygène très

élevée (plus de 10 fois la P50), une fraction importante des molécules d’hémoglobine ne fixe pas l’oxygène

c. Pour une pression partielle égale à la P50, la moitié des molécules d’hémoglobine est sous forme d’oxyhémoglobine

d. En présence de monoxyde d’azote, les hématies ne peuvent fixer l’oxygène car l’hémoglobine est sous forme de méthémoglobine inactive

e. Pour une pression partielle en oxygène très élevée (plus de 10 fois la P50), les molécules d’hémoglobine sont quasiment toutes dans l’état R.

11. Indiquer parmi les propositions suivantes

celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. La myosine est la protéine constitutive des

filaments épais b. La queue de la myosine est constituée de 2

hélices α super-enroulées

c. La queue de la myosine ne contient pas de chaîne légère

d. La queue de la myosine contient une activité ATPasique

e. La queue de la myosine forme des liaisons avec les molécules d’actine lorsque la myofibrille est au repos

12. On dispose d’une substance pharmacologique

qui inhibe spécifiquement la fixation des ions calcium sur la troponine. Parmi les conséquences possibles de l’application de cette substance au muscle squelettique, indiquer celle(s) qui est (sont) possible(s) :

a. Le blocage du canal calcium du réticulum endoplasmique

b. Le blocage du déplacement de la tropomyiosine sur l’actine

c. Le blocage de la fixation de la myosine sur l’actine

d. Le blocage de l’augmentation de la concentration en calcium dans le cytoplasme de la cellule musculaire

e. Le blocage de l’activité de la calcium-ATPase du réticulum

13. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant le récepteur nicotinique celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. Il est présent dans la membrane post-synaptique de la cellule musculaire

b. C’est un canal cationique c. Chaque récepteur possède deux sites de fixation

pour l’acétylcholine d. Le récepteur nicotinique est le canal au travers

duquel passent les ions calcium qui, en se fixant sur la troponine, déclenchent la contraction musculaire

e. Les auto-anticorps anti-récepteur nicotinique présents dans le sérum des sujets atteints de myasthénie agissent en inhibant de façon compétitive la fixation de l’acétylcholine

14. Indiquer parmi les propositions suivantes

celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. Une enzyme catalyse une réaction chimique

donnée à partir d’un ou plusieurs substrats définis b. Certaines protéines enzymatiques ont besoin

d’un cofacteur pour acquérir leur propriété catalytique

c. Les coenzymes sont des ions inorganiques d. L’équation de Michaelis-Menten est représentée

graphiquement par une courbe sigmoïde e. Dans certaines conditions, la vitesse maximale

(Vmax) d’une réaction enzymatique varie linéairement avec la concentration d’enzyme

15. Parmi les inhibiteurs suivants indiquer celui (ceux) qui réduit (réduisent) la vitesse maximale (Vmax) d’une réaction enzymatique : a. Inhibiteur compétitif b. Inhibiteur incompétitif c. Inhibiteur non-compétitif d. Inhibiteur irréversible e. Inhibiteur allostérique (enzyme du système K)

Page 27: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 27

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

QCM 2009

1. On se propose de purifier une protéine cytosolique (Protéine P) à partir d’un homogénat de foie de rat. Pour cela on soumet l’homogénat à une centrifugation différentielle. Indiquer quelle(s) fraction(s) contien(en)t la protéine P à purifier : a. Le surnageant d’une centrifugation 20000g, 20min b. Le culot d’une centrifugation 20000g, 10min c. Le culot d’une centrifugation 80000g, 1 heure d. Le surnageant d’une centrifugation 150000g,

3heures e. Le culot d’une centrifugation 150000g, 3heures

2. La fraction la plus riche en protéine P est dialysée contre un tampon phosphate 20mM pH7, NaCl 50mM, puis chromatographiée sur une résine échangeuse d’anions. Diverses protéines dont la protéine P, jusqu’alors retenues sur la résine, sont éluées par diminution du pH jusqu’à pH6. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant la protéine P, celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. Sa charge globale est nulle pour un pH compris

entre 6 et 7 b. Son point isoélectrique est supérieur à pH7 c. Son point isoélectrique est égal à pH6 d. Son point isoélectrique est compris entre pH6 et

pH7 e. Son point isoélectrique est inférieur à pH6

3. La protéine P purifiée est analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS. En absence de βmercaptoéthanol, on obtient deux bandes protéiques de 50 kDa et 25 kDa et après traitement par le βmercaptoéthanol une seule bande de 25 kDa Indiquer parmi les propositions suivantes concernant la protéine P, celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. La protéine P est constituée de 3 sous-unités

identiques b. La protéine P est constituée de sous-unités de 25

kDa c. La masse molaire de la protéine P pourrait être de

150 kDa d. Au moins deux sous-unités sont associées par

des ponts disulfure e. Une chromatographie par filtration sur gel est

nécessaire pour déterminer la masse moléculaire de la protéine P

4. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant l’électrophorèse bidimensionnelle celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. C’est une technique au cours de laquelle la charge

globale des protéines ne varie pas b. C’est une technique qui n’est pas influencée par

l’état de phosphorylation des protéines c. C’est une technique qui permet d’analyser des

protéines aussi bien eucaryotes que procaryotes d. C’est une technique au cours de laquelle la

séparation des protéines en fonction de leur masse nécessite un gradient de SDS

e. C’est une technique qui peut servir d’étape préparatoire à une analyse par spectrométrie de masse

5. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant la sérine celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. Elle contient trois atomes de carbone b. Elle contient un atome de soufre c. Elle porte une fonction ionisable dans sa chaîne

latérale d. Sa charge globale est nulle à pH 6 e. Elle est phosphorylable

6. Un peptide dont la séquence est la suivante : val-val-glu-gly-arg-trp-ala-gln-leu-trp-phe-val-ala-ala

est soumis à l’action de la trypsine. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant ce peptide celle qui est (sont) exacte(s) : a. Il présente une charge globale positive à pH 7 b. Il contient un résidu d’alanine à l’extrémité C-

terminale c. L’action de la trypsine donne naissance à trois

peptides d. L’action de la trypsine donne naissance à deux

peptides ayant chacun une charge globale nulle à pH 7

e. L’action de la trypsine donne naissance à deux peptides dont un seul absorbe la lumière ultraviolette

val = valine, glu = acide glutamique, gly = glycine, arg = arginine, trp = tryptophane, ala = alanine, gln = glutamine, leu = leucine, phe = phenylalanine, 7. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant les coudes, celle(s) qui est (sont) exacte(s) a. Ils permettent des connexions entre structures

secondaires b. Quatre résidus d’acide aminé sont impliqués

dans certains coudes b c. Ce sont des structures répétitives d. Un coude β est stabilisé par une liaison

hydrogène e. Ils contiennent des taux élevés de proline

8. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant la structure de la myoglobine, celle(s) qui est (sont) exacte(s) a. Sa structure tertiaire est déterminée par sa

structure primaire b. Sa dénaturation par l’urée 8M n’empêche pas la

liaison de l’O2 c. La fixation de l’O2 n’est pas modifiée par un

traitement par le βmercaptoéthanol d. Elle contient de nombreux feuillets bêta e. Le fer est lié au reste de l’hème par 6 liaisons de

coordination 9. Indiquer parmi les propositions suivantes concernant l’hémoglobine celle(s) qui est (sont) exacte(s) a. L’hémoglobine désoxygénée est très

majoritairement dans l’état tendu T b. L’état tendu T est stabilisé par la fixation du 2,3

DPG c. En absence de 2,3 DPG, l’hémoglobine est très

majoritairement dans l’état tendu T d. En absence de 2,3 DPG, l’hémoglobine est dans

un état conformationnel à haute affinité pour l’oxygène

e. Dans le modèle séquentiel une molécule d’hémoglobine peut contenir à la fois des sous unités dans l’état T et d’autres dans l’état R.

Page 28: 1. Protéines - aristote.datacenter.dsi.upmc.fraristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/PCEM1/ED/01_Prot2009-10.pdf · Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3 Faculté de

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 28

Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie

10. On analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS une immunoglobuline G et ses fragments. Indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) a. L’immunoglobuline en absence de

βmercaptoéthanol donne deux bandes protéiques de 25 et 50 kDa

b. L’immunoglobuline en absence de βmercaptoéthanol donne une seule bande protéique de 75kDa

c. L’immunoglobuline en présence de βmercaptoéthanol donne deux bandes protéiques de 25 et 50 kDa

d. Le fragment Fab en absence de βmercaptoéthanol donne une seule bande protéique

e. Le fragment Fc en présence de βmercaptoéthanol donne une seule bande protéique

11. Indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) : a. La troponine est une protéine trimérique b. La troponine possède des sites spécifiques pour

les ions Ca++ c. La troponine possède un site d’interaction avec la

myosine d. La troponine possède une activité ATPasique e. La troponine possède une sous-unité qui interagit

directement avec la tropomyosine

12. L’application de curare à la jonction musculaire induit un blocage spécifique du récepteur nicotinique. Si dans ces conditions on stimule le nerf moteur, indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) a. Le myocyte ne se contracte pas b. les canaux Ca++ sensibles au voltage de la

terminaison nerveuse ne sont pas activés c. les canaux Na+ sensibles au voltage de la

membrane plasmique du myocyte ne sont pas activés

d. les ions Ca++ sont libérés par le reticulum endoplasmique et envahissent le cytoplasme du myocyte

e. La libération d’acétylcholine par la terminaison nerveuse est inhibée

13. Indiquer parmi les propositions suivantes

concernant le récepteur nicotinique de l’acétylcholine celle(s) qui est (sont) exacte(s) :

a. L’hélice M2 est la seule hélice portant des résidus hydrophiles à sa surface

b. Chaque sous-unité contient 4 hélices transmembranaires

c. Chaque récepteur possède deux sites de fixation pour l’acétylcholine dans le domaine cytoplasmique de la protéine

d. L’occupation d’un seul des deux sites par une molécule d’acétylcholine permet l’ouverture du canal

e. Dans la myasthénie, les auto-anticorps bloquent la libération d’acétylcholine