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La réponse de la modélisation moléculaire

Eduardo DE OLIVEIRA

Catherine HUMEAU

Elaine-Rose MAIA

Séminaire Annuel Séminaire Annuel RP2ERP2E -- Le 15 janvier -- Le 15 janvier 20092009

Pourquoi les lipases sont-elles régiosélectives

dans l'acylation de flavonoïdes ?

Latifa CHEBIL

Mohamed GHOUL

Jean-Marc ENGASSER

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INTRODUCTIONET

OBJECTIFS

3

• Composés Composés polyphénoliquespolyphénoliques à faible poids moléculaire à faible poids moléculaire

Les flavonoïdesLes flavonoïdes

Vaste spectre de Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiquespropriétés biologiques bénéfiques, mais…, mais…

… … faible solubilitéfaible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. en milieu hydrophile et hydrophobe.

(Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007)

• Métabolites secondaires de nombreuses Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétalesespèces végétales

(…)(…)

(…)(…)

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• Permet d’augmenter leur hydrophobicité (Permet d’augmenter leur hydrophobicité (lipophilisationlipophilisation))

• Peut être accomplie par voie Peut être accomplie par voie chimiquechimique ou ou enzymatiqueenzymatique

Acylation de flavonoïdesAcylation de flavonoïdes

(Chebil et al., 2006, Villeneuve et al., 2007)

• VOIE CHIMIQUE :VOIE CHIMIQUE :

• VOIE ENZYMATIQUE :VOIE ENZYMATIQUE :

OHOH

OHOH

OHOH

HOHO

OHOH

OHOH

OHOH

HOHO

OO-R-R

OHOH

OHOH

HOHO

OHOH

HOHO

R-R-OO

OO-R-R

Donneur

d’acyle (R)

P, T, milieu basique

Donneur

d’acyle (R)

Enzyme

OO-R-RR-R-OO

OO-R-R

OO-R-R

OO-R-R

HOHO

OHOH

OO-R-R

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• ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiquesENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques

• LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions :LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions :– Hydrolyse de liaisons ester en milieu aqueuxHydrolyse de liaisons ester en milieu aqueux– Formation de liaisons ester en milieu organiqueFormation de liaisons ester en milieu organique

• De nombreuses applications en biotechnologie De nombreuses applications en biotechnologie (Jaeger, 2002)

• Lipase la plus utilisée : Lipase la plus utilisée : Candida antarcticaCandida antarctica lipase B (CALB) lipase B (CALB)

LipasesLipases

Structure de la CALB Cavité du site actif :

« Triade catalytique » au fond

6

Deux cas d’acylation de Deux cas d’acylation de flavonoïdes en utilisant la flavonoïdes en utilisant la

CALB CALB

O

OHOHHO

OH

O

OHOH

OOH

HO

O

• ISOQUERCITRINE :ISOQUERCITRINE :

O

OHOHHO

O-CO-CH-CO-CH33

O

OHOH

OOH

HO

O

Vinyl-

acetate

CALB

(Nakajima et al., 1999 ; Stevenson et al., 2006 ; Chebil et al., 2007)

O

OHOH

OOH

HO

OH

O

OHOH

OOH

HO

OH

• QUERCÉTINE :QUERCÉTINE :

Vinyl-

acetate

CALB

(Ardhaoui et al., 2004 ; Chebil et al., 2007)

Aucune réaction

6’’OH

7

Utiliser des outils de SIMULATION MOLECULAIRE pour expliquer, dans le cas de l'acétylation enzymatique de l’isoquercitrine et de la quercétine, catalysée par

la lipase B de Candida antarctica (CALB) :

(A) LA SPECIFICITÉ :Pourquoi la CALB est-elle capable de catalyser l’acétylation de l'isoquercitrine mais pas celle de la quercétine ?

(B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ :Pourquoi, dans le cas de l'isoquercitrine, seulement un groupement hydroxyle (6’’-OH) précis du substrat réagit ?

ObjectifsObjectifs

8

METHODOLOGIE

9

Outils de simulationOutils de simulation

• Structure Structure cristallographiquecristallographique de l’enzyme CALB : de l’enzyme CALB : – Obtenue sur la Obtenue sur la Protein Data Bank (PDB)Protein Data Bank (PDB)– Code Code 1LBS1LBS

• LogicielsLogiciels– Discovery Studio (v.1.7)Discovery Studio (v.1.7)– Insight (v. 2005)Insight (v. 2005)– Champ de forces :Champ de forces :

• CHARMmCHARMm

– Algorithme de docking : • LigandFit

10

Chacune de ces orientations est placée dans la

cavité (« pose »)

Principe du dockingPrincipe du docking

Exploration de l’espace

conformationnel du ligand

Chaque conformation :

4 orientations

possibles

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Choix de poses Choix de poses favorablesfavorables

Complémentarité géométrique :

BONNE ADEQUATION DE FORME AVEC LA CAVITE

Complémentarité chimique :

INTERACTIONS FAVORABLES AVEC LES RESIDUS PROCHES

• Liaisons H • Électrostatiques• Aromatiques (- et -)• Van der Waals • (…)

15.000 conformères (= 60.000 poses) GÉNERÉES…

… et seules les 50 les plus favorables RETENUES

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Mécanisme réactionnel Mécanisme réactionnel simplifiésimplifié

(adapté de Uppenberg et al., 1994)

Enzyme libre

CIBLE DE DOCKING

SUBSTRAT DOCKÉ

Flavonoïde (accepteur d’acyle)

FH3C

F – OH

Flavonoïde acylé

Enzyme régénérée

H2C = CH

OH

CH3

Acyl-enzyme

H3CCH=CH2

Vinyl-acétate (donneur d’acyle)

13

(1)

(3)

(2)

L’étape critiqueL’étape critique

(1)Liaisons H entre ACE et les résidus Thr40 et Gln106

(2)Transfert de proton (activation de l’accepteur l’acyle)

(3)Attaque nucléophile sur l’acyle-enzyme

HO

OHOH

OHOH

HOHO Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme

(adapté de Hult et al., 1998, 2000, 2001)

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≤ 4Å

≤ 4Å

Analyse des poses retenuesAnalyse des poses retenues

HO

OHOH

OHOH

HOHO

MODE DE LIAISON MODE DE LIAISON PRODUCTIFPRODUCTIF : :

• Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction.Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction.• Le substrat docké doit obéir à Le substrat docké doit obéir à trois conditionstrois conditions : :

2 ou 3 liaisons H

(Botta et al., 2002 ; Vallikivi et al., 2005 ; Palocci et al., 2007)

Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme

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RESULTATSET

DISCUSSION

16

IsoquercitrineIsoquercitrine

OOHOH

HO

OH

OOH

OH

OOH

HO

O

Mode de liaison 1

PARTIE SUCRESUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ

O OH

OH

HOO

H

O

OH

OH

OO

H

HOO

PARTIE PHÉNOLIQUEPHÉNOLIQUE AU FOND DE LA CAVITÉ

Mode de liaison 2

17

Mode de liaison 1Mode de liaison 1

SUCRESUCRE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE

+ hydrophobe+ hydrophile

VUE 1 : VUE VUE 1 : VUE FRONTALEFRONTALE DE LA CAVITE DE L’ENZYME DE LA CAVITE DE L’ENZYME (SURFACE DE CONNOLLY)(SURFACE DE CONNOLLY)

Partie phénolique à l’entrée

Partie sucre vers

le fond

Ile189

Val149

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Mode de liaison 1Mode de liaison 1SUCRESUCRE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE

VUE 2 : VUE VUE 2 : VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT

Thr40

His224

Asp187

Ile189

Val149

Ser105

Gln106

ACE

• 3’’-OH :

• His224:N : 8.7 Å

• ACE:C : 7.4 Å

• 4’’-OH :

• His224:N : 6.2 Å

• ACE:C : 4.6 Å

• 6’’-OH :

• His224:N : 4.0 Å

• ACE:C : 3.5 Å

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Mode de liaison 2Mode de liaison 2PARTIE PHÉNOLIQUEPARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE

VUE VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT

Thr40

His224

Asp187

Ile189

Val149

Ser105

Gln106

ACE

• 5-OH :

• His224:N : 8.3 Å

• ACE:C : 5.6 Å

• 7-OH :

• His224:N : 7.1 Å

• ACE:C : 5.2 Å

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QuercétineQuercétineMode de liaison 1

AC

B

CYCLE AA AU FOND DE LA CAVITÉ

A

C

B

Mode de liaison 2

CYCLE BB AU FOND DE LA CAVITÉ

21

Mode de liaison 1Mode de liaison 1CYCLE ACYCLE A AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE

VUE VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT

His224

Asp187

Thr40

Ser105

Gln106

ACE• 5-OH :

• His224:N : 6.3 Å

• ACE:C : 4.3 Å

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Mode de liaison 2Mode de liaison 2CYCLE BCYCLE B AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE

VUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ETVUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ET

DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT

His224 Asp187

Thr40

Ser105

Gln106

ACE

Gln157

• 3’-OH :

• His224:N : 6.2 Å

• ACE:C : 5.7 Å

• 4’-OH :

• His224:N : 4.5 Å

• ACE:C : 3.7 Å

23

CONCLUSIONS

24

O

OHOHHO

O--CO-CHCO-CH33

O

OHOH

OOH

HO

O

His224

ACE

His224

ACE

Pas d’acétylation sur la partie phénolique et…

… acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.

Acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.

ISOQUERCITRINE

OK OK

25

His224

ACEHis224

ACE

… ni sur le cycle A. Pas d’acétylation sur le cycle B…

O

OHOH

OOH

HO

OH

Aucune réaction

QUERCÉTINE

OK OK

26

Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF

::(1)(1) 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le

« oxyanion hole »« oxyanion hole »(2)(2) Au moins un OH à Au moins un OH à ≤ 4 ≤ 4 Å de l’atome Ace:C Å de l’atome Ace:C (3)(3) Au moins un OH à Au moins un OH à ≤ 4 ≤ 4 Å de l’atome His224:NÅ de l’atome His224:N

(A) LA SPECIFICITÉ :Isoquercitrine : au moins un mode de liaison satisfait aux critères de réactivité = réaction OK OK Quercétine : aucun mode de liaison ne satisfait aux critères de réactivité = absence de réaction NON NON

(B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ :6’’-OH : le seul OH de l’isoquercitrine satisfaisant aux critères de réactivité (donc le seul à pouvoir réagir).

MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ?MODÈLES EXPÉRIENCE

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Équipe Biocatalyse-Bioprocédes - LIBio – ENSAIA /

INPL

• Eduardo Basilio DE OLIVEIRA (doctorant - 3ème année)

• Catherine HUMEAU (Maître de conférences)

• Mohamed GHOUL (Professeur)

• Jean-Marc ENGASSER (Professeur)

• Latifa CHEBIL (Maître de conférences)

• Évelyne RONAT (Informaticienne)

Collaborateurs – experts en Modélisation Moléculaire

• Elaine-Rose MAIA (Professeur – Université de Brasilia – Brésil)

• Bernard MAIGRET (Directeur de recherche - LORIA –CNRS)

MERCI DE VOTRE MERCI DE VOTRE ATTENTION !ATTENTION !