23/01/18

1

A"uazionediprotocolliperl’analisiprenataledianeuploidieFrancescaTorricelli

torricellifr@gmail.com

DNA libero circolante nel plasma materno •  DNA libero circolante: DNA materno + DNA fetale

•  Origine: apoptosi del citotrofoblasto

•  Frammentato (143 bp in media)

•  Presente a partire dalla 5a settimana di gravidanza

•  La quantità di cffDNA aumenta con l’età gestazionale

•  Il DNA di origine fetale è in percentuale variabile : 5-15% del DNA circolante totale (10-20° settimana di gestazione)

Cara"eris;checffDNA Vantaggi

Presente nel plasma materno precocemente (4-5 sett)

(Lo YM et al 1998)

Diagnosi precoce

Rapida clearance dopo il parto (Lo YM et al 1999)

Gravidanza-specifico

Rappresentativo del genoma fetale totale (Lo Y et al 2010)

Analisi di qualsiasi regione genomica fetale

DNA libero circolante nel plasma materno Applicazioni diagnostiche della NIPD su cffDNA

Ø  Malattie autosomiche recessive (β-

talassemia, Fibrosi Cistica, ecc)

§  Esclusione della mutazione paterna

(Coppia con difetti molecolari

diversi ) o analisi indiretta;

§  Determinazione del genotipo fetale

mediante studio di aplotipi;

Ø  Determinazione del sesso fetale nelle gravidanze a rischio per

malattie genetiche X-linked;

Ø  Determinazione del genotipo fetale RHD in donne Rh D–negative;

Ø  Malattie autosomiche dominanti (Acondroplasia, Morbo di

Huntigton, ecc) di origine paterna o de novo;

Lo et al.2009 Trends in Genet.

DNA materno

DNA fetale

Liu et al.2016 Trends in Mol. Med.

CVS o LA DNA fetale libero circolante

NGS e test prenatali non invasivi

E’ quindi necessaria una

metodica in grado di evidenziare variazioni molto piccole di DNA

Lenuovetecnologiedisequenziamentoconsentonodio9eneregrandiquan;tàdida;disequenzainunsingoloesperimento

NGS e test prenatali non invasivi

Questo approccio consente di identificare le aneuploidie più frequenti sequenziando, mappando e contando le molecole di

DNA per evidenziare «variazioni nel numero di copie» di uno specifico cromosoma, a partire da DNA totale circolante nel plasma

materno

23/01/18

2

Il valore prediBvo posi;vo dipende dalla Sensibilità e dalla Specificità del test: inpar;colare,essoaumentaconl'aumentarediques;dueparametri.

NIPT:PPVeNPV

PPV =

(Sensibilità x prevalenza)

((Sensibilità x prevalenza)+(1-specificità)x(1-prevalenza))

Specificità x (1-prevalenza)

((1-sensibilità) x prevalenza + specificità x(1-prevalenza)) NPV =

É però importante sottolineare che il valore predittivo positivo dipende anche da un fattore indipendente dal test: la prevalenza della malattia nella popolazione sottoposta a screening.

PPVe

NPV

Quali sono le possibili cause di un test NIPT inconclusivo?

Le percentuali di fallimento del test NIPT sono estremamente eterogenee (da 0 a 12%) e non direttamente correlabili al metodo d’analisi utilizzato o all’epoca gestazionale.

Cause biologiche/sperimentali: •  frazione fetale inferiore al 4%; •  problemi nell’estrazione del

DNA, nell’amplificazione o nel sequenziamento dei campioni;

Inadeguatezza del campione: •  volume sangue insufficiente; •  emolisi; •  errori di etichettatura provette; •  ritardo nella consegna dei

campioni.

Fallimento Test NIPT : percentuali e cause

Gil MM et al. UOG 2017 Int J Womens Health 2015 Jan 16;7:113-26.

Global availability of noninvasive prenatal genetic testing (NIPT)

NIPT : A CHE PUNTO SIAMO?

23/01/18

3

NIPT e DPCM LEA 12-01-2016

90.17.6HCGFRAZIONELIBERAEPAPP-A.Daeseguiresoloinassociazionecon88.78.4Incluso:consulenzapreeposttestcombinato(1°trimestre)88.78.4ECOGRAFIAOSTETRICAPERSTUDIODELLATRASLUCENZANUCALE.Incluso:consulenzapreeposttestcombinato.Daeseguireesclusivamentetra11se\mane+0gge13se\mane+6gg

AllegatoBPRESTAZIONI SPECIALISTICHE PER IL CONTROLLO DELLA GRAVIDANZA FISIOLOGICA,ESCLUSEDALLAPARTECIPAZIONEALCOSTO

NIPT e DPCM LEA 12-01-2016

ART59.5Nelle specifiche condizioni di rischio fetale indicatedall'allegato10C,sonoescluse dalla partecipazione al costo leprestazionispecialis;cheambulatorialinecessarieedappropriateperlavalutazionedelrischioela successiva diagnosi prenatale,prescri9edallospecialista. Le regioni e le province autonomeindividuanolestru"uredi riferimento per l'esecuzione di taliprestazioni, garantendo che le stesse stru9ure forniscano alledonneeallecoppieunadeguatosostegno.

23/01/18

4

NIPT e DPCM LEA 12-01-2016

ALLEGATO10CCONDIZIONIDIACCESSOALLADIAGNOSIPRENATALEINVASIVA

1)  Rischioprocrea;voprevedibileapriori…davalutareinsedediconsulenzagene;ca

2) Rischio rilevato in corso di gravidanza: dife\ fetali evidenzia;mediante ecografia, alterazione di parametri biochimici/molecolaririleva; con sistemi valida; ed eroga; presso stru9ureappositamenteindividuatedalleregioni,predi\vidipatologiefetalie/ocromosomiche/geniche,patologieinfe\vearischiofetale.

NIPT e DPCM LEA 12-01-2016

Lecondizioniperlequalièprevistol’accessoalladiagnosiprenataleinvasivasono:

1)Perleindaginecitogene;che:probabilitàditrisomia21,odialtreanomaliecromosomiche1/300almomentodeltestperlavalutazionedelrischionelprimotrimestre(o1/250incasoditestnelsecondotrimestre)calcolatasecondoimetodiindica;dalleRegionitraquellibasa;sullaetàmaternaincombinazioneconaltriparametriecograficifetalie/odilaboratorio.Tale calcolo dovrà essere effe"uato u;lizzando specifici protocollinell’ambito di programmichegaran;scanouniformitàdiaccessointu9oilterritorioregionale, inCentri individua;dallesingoleregionieso9opos;averificacon;nuadellaqualità.L’opzionedapartedelleRegionideveessereorientataall’adozionedimetodidicalcolodelrischioconunamaggioresensibilitàdiagnos;caeunminornumerodifalsiposi;vitenutocontodell’evoluzionedellaricercascien;ficaetecnologica.2)Perleindaginigene;che……3)Perleindaginiinfe\vologiche……

SIGUSANITA’22-Febbraio2017

ORDINEdelGiorno• PresentazioneNomenclatoreFrancescaTorricelli(Firenze)

• Presentazionedeida;sulloscreeningdelduotestcombinato(protocolli,risulta;,falsiposi;vienega;vi,cos;)ErichCosmi(Padova)

• Presentazionedeida;sulloscreeningdellaNIPT/NIPS(protocolli,risulta;,falsiposi;vienega;vi,cos;)AnnaCon;(Napoli)

• Presentazionedipropostedipercorsigiàado9a;oinesserediadozione(Toscana.,Liguria,FriuliVeneziaGiuliaecc) • Discussione

Propostadelgruppodilavororistre"operlaprimaBozzadelpercorso,foglioinforma;voeconsensiperlaNIPS.

NIPT Linee guida Ø  Ministero della Salute- Consiglio Superiore di Sanità-Sezione I Linee-Guida Screening prenatale non

invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing NIPT). 2015 Ø  Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) Publications Committee #36: Prenatal aneuploidy

screening usingcell-free DNA Am J ObstetGynecol 2015; 212(6):711-6 Ø  American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) Cell-free DNA screening for fetal

aneuploidy. Committee Opinion No. 640. Obstet Gynecol 2015;126:31–7 Ø  The International Society for Prenatal Diagnosis (ISPD) Position statement from the Chromosome

Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis Benn P et al, Prenat Diagn 2015; 35: 725-34

Ø  The European Society of Human Genetics (ESHG) and American Society of Human Genetics (ASHG)

joint policy statement. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening. Dondorp et al, Eur J Hum Genet (2015) 23, 1438–1450; (2015)

Ø  Società Italiana Genetica Umana (SIGU) Documento di indirizzo sull’impiego di indagini prenatali non invasive 2016

Ø  ACMG Practice Resources. Diagnostic cytogenetic testing following positive noninvasive prenatal screening results: a clinical laboratory practice resources of America College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) Cherry AM et al Genetics in Medicine, 2017 Aug; 19 (8): 845-850

23/01/18

5

Valutazione del ruolo del test NIPT e della NT eseguita nel

primo trimestre per la determinazione di anomalie

cromosomiche in un campione di 5306 donne ad

alto rischio.

NIPT flowchart

NHS-UKIntermediaterisk<1in150NIPT

NHS-UKHighrisk>1in150CVSoLA

DutchMinisterofHealthApril2017NIPTfirst-;erscreeningforallpregnancy,secondtrimesterfetalanomalyscan(FAS)eSNParrayonCVS/AFCSrebniaketal,HumanMuta;on2017

Non è stato raggiunto un consenso riguardo all’indicazione sul referto dei valori di Frazione

Fetale, di PPV e NPV. NB! ACMG 2016 raccomanda di includere FF,

DR, sensibilità, specificità, PPV e NPV

Al fine di creare in Europa dei controlli di qualità esterni e fornire raccomandazioni per l’elaborazione dei risultati NIPT, sono stati invitati 2726 laboratori a fornire due tipologie di referto di NIPT:

1)  RISCHIO ELEVATO DI ANEUPLOIDIA FETALE;

2) BASSO RISCHIO DI ANEUPLOIDIA FETALE. Solo 121 laboratori (4,8%) hanno fornito i referti richiesti. I risultati sono stati discussi durante l’ISPD 2016 e contestualmente è stato prodotto un Consensus opinion e formulate delle Linee Guida sulla compilazione dei referti NIPT.

NIPT report: a consensus opinion REFERTO NIPT SECONDO ISO 15189:

Informazioni Paziente: NOME e DATA di NASCITA . Informazioni Campione: TIPO DI CAMPIONE, DATA di RACCOLTA del campione e DATA di ricevimento del campione in laboratorio. Informazioni Cliniche: EPOCA GESTAZIONALE della paziente al momento del prelievo (definita mediante ecografia). Informazioni Referto: DATA DI REFERTAZIONE e dati del DESTINATARIO. Informazioni Test di Laboratorio: METODOLOGIA utilizzata (ex.NGS) e LIMITI del test. Risultato del Test: non deve essere utilizzata la Internal System for Cytogenomic Nomenclature poiché si tratta di un test NON diagnostico. Si consiglia l’impiego della dicitura: ‘ ’ R I S C H I O E L E VAT O O B A S S O R I S C H I O D I ANEUPLOIDIA FETALE’’ In caso di RISCHIO ELEVATO DI ANEUPLOIDIA FETALE deve essere evidenziata la necessità di confermare il risultato con diagnosi prenatale invasiva.

Trisomia 21 Dati: 1923 gravidanzeT21 e 223.932 gravidanze non-T21 (30 studi). DR generale: 99.7% (95% CI, 99.1-99.9%) FPR generale: 0.04% (95% CI, 0.02-0.07%) DR range: 94.4%-100% FPR range: 0%-0.94%

Trisomia 18 Dati: 563 gravidanzeT18 e 222.013 gravidanze non-T18 (25 studi). DR generale: 97.9% (95% CI, 94.9-99.1%) FPR generale: 0.04% (95% CI, 0.03-0.07%) DR range: 87.5%-100% FPR range: 0%-0.22%

Monosomia X Dati:36 gravidanze non gemellari X0 e 7676 gravidanze XX (11 studi). DR generale: 95.8% (95% CI, 70.3-99.5%) FPR generale: 0.14% (95% CI, 0.03-0.07%) DR range: 66.7%-100% FPR range: 0%-0.49%

Trisomia 13 Dati:119 gravidanzeT13 e 212.883 gravidanze non-T13 (23 studi). DR generale: 99.0% (95% CI, 68.8-100%) FPR generale: 0.04% (95% CI, 0.03-0.07%) DR range: 40.0%-100% FPR range: 0%-0.25%

Gil MM et al. UOG 2017

Performance generali del test

Trisomia 21 GEMELLARI Dati: 24 gravidanze T21 (5 studi). DR generale: 100% (95% CI, 95.2-100%) FPR generale: 0.00% (95% CI, 0,00-0.003%)

Trisomia 18 GEMELLARI Dati: 14 gravidanze T18 (3 studi). DR generale: 92,8% FPR generale: 0.00%

Trisomia 13 GEMELLARI Dati: 1 gravidanza T13 (1 studio). DR generale: 0.00% FPR generale: 0.00%

ScreeningbyanalysisofcfDNAinmaternalbloodinsingletonpregnanciescoulddetect:>99%offetuseswithtrisomy21,98%oftrisomy18and99%oftrisomy13atacombinedFPRof0.13%.

Thenumberofreportedcasesofsexchromosomeabnormali;esistoosmallforaccurateassessmentofperformanceofscreening.

Intwinpregnanciesperformanceofscreeningfortrisomy21isencouragingbutthenumberofcasesreportedissmall.

Performance generali del test NIPT Riassumendo

Nonraccomandatoperaltreanomaliecromosomiche/microdelezioni

NIPTNega;vo/low-riskdeponefortementeperassenzadelletrisomiericercate

NIPTPosi;vo/high-riskdeveandareaprocedurainvasiva

IngravidanzesingoleNIPTèsuperioreinterminidiDR,FPR,PPVeNPVaqualsiasialtrometododiscreeningcombinatoperT21,T18,T13

Tu\icasiconanomaliestru9uralievidenziateconultrasuonidovrebberoeseguiretestinvasivo

23/01/18

6

Cara"eris;che:-RIDUZIONEFALSINEGATIVI-RIDUZIONEFALSIPOSITIVI-RIDUZIONEDIAGNOSIINVASIVE-RIDUZIONEABORTISPONTANEIlega;alleprocedurediprelievo-ATTUALMENTEMOLTOPIÙCOSTOSOrispe9oaicos;dell’a9ualeprogrammadiscreeningprenataleediagnosiinvasiva.

Cara9eris;che:-RIDUZIONEFALSINEGATIVI-RIDUZIONEFALSIPOSITIVI-RIDUZIONEDIAGNOSIINVASIVE-RIDUZIONEABORTISPONTANEIlega;alleprocedurediprelievo-COSTIDAVALUTARErispe9oaicos;deiprogrammia9ua;almomentonellevarieregioni.

Cara9eris;che:-RIDUZIONEFALSINEGATIVI-RIDUZIONEFALSIPOSITIVI-RIDUZIONEDIAGNOSIINVASIVE-RIDUZIONEABORTISPONTANEIlega;alleprocedurediprelievo-COSTIDAVALUTARErispe9oaicos;deiprogrammia9ua;almomentonellevarieregioni

Colosi,Peri;2016TheJournalofMaternal-FetalandNeonatalMedicine

Da;occorren;alleRegioniperstabilireilpercorso

Ø  IlN°totaledigravidanze;

Ø  IlN°testcombina;

Ø  IlN°ditestcombina;risulta;adaltorischio,perquestosipotràconsiderareil5-7%deltotaledeitestcombina;effe9ua;,datoriportatodamol;autoriinle9eratura;

Ø  IlN°didiagnosiinvasivedatestcombinatoadaltorischiofinoa1/300

Ø  IlN°ditestcombina;conrisultatoarischiointermedio1/301--1/1000

Ø  IlN°ditestNIPTsutestcombinatoconrisultatoarischiointermedio(stessonumero)

Ø  IlN°ditestDiagnosiPrenataliInvasivesutestNIPTconrisultatoarischioalto

23/01/18

7

CONCLUSIONISeproponiamolaNIPTatu"eledonneingravidanzaproponiamoilmetododiscreeningperleaneuploidiepiùfrequen;conlaDRpùalta98%elapiùbassapercentualedifalsiposi;vi0,4%quindiriduciamoleinvasivemaperdiamolapercentualedimicrodelezionieriarrangiamen;inquelledonnechenega;venonvannoall’invasivaSeproponiamoilsolotestcombinatoproporremmountestconunaDRpiùbassa85-90%econfalsiposi;vipiùal;5-6%diFalsiPosi;viquindimaggioridiagnosiprenataliinvasiveSeproponiamoilcon;ngentato:eseguiremoilcombinatoatu"eledonneingravidanzaeinvieremoledonneconaltorischioallainvasiva.Quindiandràstabilitoqualesaràilcut–offcheconsideriamoaltorischioSe1/300::nondiminuiamoleinvasive,moltesarannoFalseposi;vemarecuperiamoalcuneanomaliecromosomicheSe1/10diminuiamoleinvasivemaperdiamoalcuneanomaliecromosomicheSe1/100aumen;amolediagnosiinvasivetrascinandocimaggiorifalsiposi;vi

Potremmoproporre§  1/50invasiva

§  ledonneconbassorischio1/51-1/1000andrannoaltestdellaNIPT

§  Ledonnenega;veallaNIPToconunrischiosuperiorea1/1001eoltrea12se?maneverrannomonitorizzateconunaecografiaperlaricercadimarcatoriconsignificatoclinico.

§  ledonneconpresenzadimarcatoriecograficiconsignificatoclinicoandrannoversoSNPsArray.Inquestomodoriduciamoilnumerodelleinvasiveediagnos;chiamoancheleanomaliecromosomiche

Cosavogliamoraggiungere1.   NIPTatu9eleDonneingravidanza2.   Ricercamarcatoriecograficia12se\mane3.   InvasivaconSNPs–Arrayperimarcatori

clinicamentesignifica;va

CosacimancaA.   CentralizzazionedeltestNIPTB.   Centralizzazionecentridiecografiaper

marcatoriecograficiC.   CentralizzazioneSNP–arrayidiagnosi

prenatale

GRAZIE