· ecole nationale veterinaire de lyon année 2003 - thèse n° 107 etude experimentale de la...

ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2003 - Thèse n° 107

ETUDE EXPERIMENTALE DE LA TRANSMISSION PAR AEROSOLS DE L’AGENT DE LA FIEVRE Q (Coxiella burnetii)

SUR MODELE MURIN

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 06 octobre 2003 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

Fanny MAGISSON-RICCI Elève de l’Ecole du Service de Santé des Armées de Lyon-Bron

Née le 07 octobre 1978 à Remiremont (Vosges)

A Monsieur le Professeur FABRY Professeur de la Faculté de Médecine de LYON,

Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse. Hommages respectueux.

A Monsieur le Professeur PRAVE Professeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de LYON,

Qui nous a encadré dans l’élaboration de ce travail, Pour sa gentillesse, sa disponibilité et sa rigueur dans le travail,

Qu’il trouve ici l’expression de ma sincère reconnaissance

A Monsieur le Professeur CHANTEGRELET Professeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de LYON,

Qui a aimablement accepté d’être membre de notre jury de thèse. Hommages respectueux.

A Monsieur le Vétérinaire Biologiste en Chef DAVOUST Conseiller Vétérinaire Interarmées Sud-Est,

Qui a proposé et coordonné ce travail Et nous a fait l’honneur de participer à notre jury de thèse,

Pour sa gentillesse, sa disponibilité et son efficacité. Sincères remerciements.

A Monsieur le Vétérinaire Biologiste en Chef BAYLAC Chef de la Section NSB 3 du Centre d’Etude du Bouchet,

Qui nous a aidé à concrétiser ce travail Et nous a fait l’honneur de participer à notre jury de thèse,


A Monsieur le Professeur RAOULT Chef du Département de Microbiologie Clinique de la Faculté de Médecine de MARSEILLE

Directeur du Centre National de Référence pour l’Etude des Rickettsioses Sans qui, ce travail n’aurait jamais vu le jour.

Sincères remerciements.

A Monsieur le Professeur STEIN Professeur de la Faculté de Médecine de MARSEILLE.


A Monsieur le Professeur LEPIDI Professeur de la Faculté de Médecine de MARSEILLE


A Monsieur l’Ingénieur en Chef de l’Armement FARGERE Directeur du Centre d’Etude du Bouchet

Qui nous a fait l’honneur de nous accueillir et nous a permis de concrétiser ce travail. Sincères remerciements.

A Céline LOUVEAU Qui nous a guidé dans la réalisation de ce travail,

Mille fois merci pour ta gentillesse, ton aide, ta patience et ta disponibilité.

A tout le personnel du Département de Microbiologie du Centre d’Etude du Bouchet et en particulier à Marie-Agnès, Françoise, Isabelle, Olivier, Vincent, Valérie, Françoise,

Pour leur accueil chaleureux, leur aide et leur gentillesse.

A Séverine GENOT Pour son aide, sa bonne humeur et son soutien.


A tout le personnel de l’Unité des Rickettsies et en particulier à Frédérique, Florence, Isabelle, Ti Phong, Annick et Robert,

Pour leur aide, leur disponibilité et leur soutien.

A Monsieur le Médecin Général Inspecteur FLECHAIRE Professeur Agrégé du VAL DE GRACE

Officier de la Légion d’Honneur Officier de l’Ordre National du Mérite

Médaille d’Honneur du Service de Santé des Armées Commandant l’Ecole du Service de Santé des Armées de LYON-BRON

A Monsieur le Médecin en Chef HERMAN Chevalier de la Légion d’Honneur

Officier de l’Ordre National du Mérite Commandant en Second l’Ecole du Service de Santé des Armées de LYON-BRON

A mes Parents, Pour m’avoir donné le goût de l’effort et m’avoir permis d’arriver jusqu’ici,

Qu’ils trouvent ici l’expression de toute ma reconnaissance et de mon affection.

A ma Moitié, Pour son Amour, sa patience et son soutien de tous les instants.

A Belle-maman et Beau-papa, Pour m’avoir ouvert si chaleureusement les portes de leur famille

Qu’ils reçoivent ici toute mon affection.

A ma Sœur, Lydie, et à Thomas.

A mes Beaux-frères, Frédéric, Christophe et Thibault.

A toute ma Famille et ma Belle-famille.

A tous mes Amis d’enfance et de l’ENVL, A tous ces bons moments que nous avons partagés

En espérant qu’ils seront encore nombreux.

1

SOMMAIRE

SOMMAIRE............................................................................................................................ 1

TABLE DES ILLUSTRATIONS .......................................................................................... 5

TABLE DES ANNEXES ........................................................................................................ 7

LISTE DES ABREVIATIONS .............................................................................................. 8

INTRODUCTION................................................................................................................. 10

1ERE PARTIE : FIEVRE Q ET RISQUE BIOLOGIQUE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.......................................................................................................... 11

1. LE RISQUE BIOLOGIQUE : APPROCHE GLOBALE................................................................. 12 1.1. L’analyse du risque biologique................................................................................ 12

1.1.1. La démarche...................................................................................................... 12 1.1.2. Particularités du danger biologique .................................................................. 14

1.2. Les différents risques biologiques............................................................................ 16 2. LA FIEVRE Q ET LE RISQUE BIOLOGIQUE NATUREL ........................................................... 17

2.1. Historique ................................................................................................................ 17 2.2. Etude de l’agent ....................................................................................................... 18

2.2.1. Morphologie...................................................................................................... 18 2.2.2. Classification..................................................................................................... 20 2.2.3. Résistance ......................................................................................................... 21 2.2.4. Propriétés immunologiques .............................................................................. 21

2.2.4.1. Deux variations de phase ........................................................................... 21 2.2.4.2. Pouvoir immunigène.................................................................................. 22

2.3. Epidémiologie .......................................................................................................... 23 2.3.1. Epidémiologie descriptive ................................................................................ 23

2.3.1.1. Répartition temporelle ............................................................................... 23 2.3.1.1.1. Caractère épidémique.......................................................................... 23 2.3.1.1.2. Caractère saisonnier ............................................................................ 24

2.3.1.2. Répartition géographique........................................................................... 24 2.3.1.2.1. Dans le monde..................................................................................... 24 2.3.1.2.2. En France ............................................................................................ 36 2.3.1.2.3. Etude de l’épidémie de Chamonix (juin 2002) ................................... 38

2.3.2. Epidémiologie analytique ................................................................................. 40 2.3.2.1. Facteurs de réceptivité intrinsèques prédisposants .................................... 40

2.3.2.1.1. Espèce ................................................................................................. 40 2.3.2.1.2. Sexe..................................................................................................... 42 2.3.2.1.3. Age...................................................................................................... 42 2.3.2.1.4. Etat physiologique .............................................................................. 42

2.3.2.2. Facteurs de réceptivité extrinsèques adjuvants .......................................... 44 2.3.2.2.1. Mode d’élevage................................................................................... 44 2.3.2.2.2. Climat.................................................................................................. 44 2.3.2.2.3. Souche de Coxiella burnetii................................................................ 44

2.3.2.3. Origine de la contamination....................................................................... 45 2.3.2.3.1. Sources de contamination ................................................................... 45 2.3.2.3.2. Réservoirs ........................................................................................... 46 2.3.2.3.3. Matières virulentes.............................................................................. 46

2.3.2.4. Mode de contamination.............................................................................. 48

2

2.3.2.4.1. Transmission directe ........................................................................... 48 2.3.2.4.2. Transmission indirecte ........................................................................ 48

2.3.2.5. Voies de pénétration .................................................................................. 50 2.3.2.5.1. Voie respiratoire.................................................................................. 50 2.3.2.5.2. Voie digestive ..................................................................................... 50 2.3.2.5.3. Voie cutanée........................................................................................ 50 2.3.2.5.4. Voie congénitale ................................................................................. 50

2.3.3. Epidémiologie synthétique................................................................................ 53 2.4. Etude clinique .......................................................................................................... 53

2.4.1. La maladie animale ........................................................................................... 53 2.4.1.1. L’infection expérimentale.......................................................................... 53 2.4.1.2. L’infection naturelle................................................................................... 54 2.4.1.3. Diagnostic .................................................................................................. 56

2.4.1.3.1. Diagnostic direct ................................................................................. 56 2.4.1.3.2. Diagnostic indirect .............................................................................. 56

2.4.1.4. Traitement .................................................................................................. 57 2.4.2. La maladie humaine.......................................................................................... 58

2.4.2.1. La forme aiguë ........................................................................................... 58 2.4.2.2. La forme chronique.................................................................................... 60 2.4.2.3. Fièvre Q et terrain favorisant ..................................................................... 61 2.4.2.4. Diagnostic .................................................................................................. 62

2.4.2.4.1. Diagnostic direct ................................................................................. 62 2.4.2.4.2. Diagnostic indirect .............................................................................. 63

2.4.2.5. Traitement .................................................................................................. 66 2.4.2.5.1. Forme aiguë ........................................................................................ 66 2.4.2.5.2. Forme chronique ................................................................................. 67 2.4.2.5.3. Forme aiguë chez des patients porteurs d’une lésion valvulaire......... 67 2.4.2.5.4. Fièvre Q contractée en cours de grossesse.......................................... 68

2.5. Méthodes de prévention ........................................................................................... 69 2.5.1. Chez l’animal .................................................................................................... 69

2.5.1.1. Prophylaxie sanitaire.................................................................................. 69 2.5.1.2. Prophylaxie médicale................................................................................. 71

2.5.1.2.1. La vaccination..................................................................................... 71 2.5.1.2.2. L’association vaccination-antibioprévention ...................................... 72

2.5.2. Chez l’Homme.................................................................................................. 72 2.5.2.1. Prophylaxie sanitaire.................................................................................. 72 2.5.2.2. Prophylaxie médicale................................................................................. 72

3. LA FIEVRE Q ET LE RISQUE BIOLOGIQUE PROVOQUE INTENTIONNEL................................. 74 3.1. La guerre biologique : quelle menace ? .................................................................. 74

3.1.1. Historique.......................................................................................................... 74 3.1.1.1. Première période : de l’Antiquité à Pasteur ............................................... 74 3.1.1.2. Deuxième période : l’ère pasteurienne ...................................................... 75 3.1.1.3. 1914-1918 : la première guerre mondiale et les premières tentatives d’utilisation militaire............................................................................................... 76 3.1.1.4. Quatrième période : aux alentours de la seconde guerre mondiale ........... 76 3.1.1.5. Cinquième période : de l’après guerre à aujourd’hui................................. 77

3.1.1.5.1. Aux Etats-Unis.................................................................................... 77 3.1.1.5.2. Biopreparat.......................................................................................... 79 3.1.1.5.3. Les autres pays.................................................................................... 80 3.1.1.5.4. Le terrorisme....................................................................................... 81

3

3.1.2. Les agents pathogènes présentant un risque biologique pour l’Homme........... 83 3.1.3. Choix d’une arme biologique : militarisation des agents pathogènes............... 85

3.1.3.1. Les critères de Rosbury.............................................................................. 85 3.1.3.2. Avantages et inconvénients........................................................................ 86 3.1.3.3. Intérêts tactiques ........................................................................................ 86

3.1.4. Elaboration d’une arme biologique................................................................... 87 3.1.4.1. Acquisition................................................................................................. 87 3.1.4.2. Production.................................................................................................. 88 3.1.4.3. Moyens de propagation.............................................................................. 89

3.2. Fièvre Q : la cible humaine ..................................................................................... 92 3.3. Les moyens de contrôle............................................................................................ 93

3.3.1. Moyens techniques............................................................................................ 93 3.3.1.1. Cadre général ............................................................................................. 93

3.3.1.1.1. Moyens de détection ........................................................................... 93 3.3.1.1.2. Moyens de protection des forces armées face à une attaque biologique............................................................................................................................. 95 3.3.1.1.3. Réseaux de surveillance...................................................................... 97 3.3.1.1.4. Le plan Biotox en France.................................................................... 97

3.3.1.2. Diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii ............................................ 99 3.3.2. Les conventions de désarmement ................................................................... 101

3.3.2.1. Historique................................................................................................. 101 3.3.2.2. Le protocole de Genève de 1925 ............................................................. 102 3.3.2.3. La Convention de Washington de 1972................................................... 102 3.3.2.4. Les contrôles de désarmement ................................................................. 104

2EME PARTIE : INFECTION PAR AEROSOLS SUR MODELE MURIN : ETUDE EXPERIMENTALE ........................................................................................................... 107

1. OBJECTIFS ...................................................................................................................... 108 2. MATERIEL ET METHODE ................................................................................................. 108

2.1. Installations et matériel utilisé............................................................................... 108 2.1.1. Souris .............................................................................................................. 108 2.1.2. Souches de Coxiella burnetii .......................................................................... 109 2.1.3. Environnement................................................................................................ 109

2.1.3.1. Tenue de protection.................................................................................. 110 2.1.3.2. Procédure d’entrée/sortie ......................................................................... 110 2.1.3.3. Dispositifs de sécurité .............................................................................. 111

2.1.4. Caisson à aérosols ........................................................................................... 112 2.1.5. Biocollecteur en phase liquide : AGI 30 ou impinger .................................... 115

2.2. Déroulement de l’étude.......................................................................................... 116 2.2.1. Protocole général ............................................................................................ 116 2.2.2. Déroulement des aérosols ............................................................................... 117 2.2.3. Techniques de prélèvements ........................................................................... 118 2.2.4. Techniques d’analyses mises en œuvre .......................................................... 119

2.2.4.1. Sérologie .................................................................................................. 119 2.2.4.2. Analyse anatomopathologique................................................................. 120 2.2.4.3. Immunohistochimie ................................................................................. 120 2.2.4.4. Analyse statistique ................................................................................... 121 2.2.4.5. Détection par LCN (Light Cycler nested PCR) ....................................... 121

4

2.2.4.5.1. Extraction de l’ADN......................................................................... 122 2.2.4.5.2. Amplification génomique par nested PCR ....................................... 122 2.2.4.5.3. Séparation des séquences amplifiées par électrophorèse.................. 125

3. RESULTATS .................................................................................................................... 126 3.1. Lésions macroscopiques ........................................................................................ 126 3.2. Résultats de la détection par Light Cycler nested PCR......................................... 127

3.2.1. Détection de Coxiella burnetii dans l’aérosol................................................. 127 3.2.2. Détection dans les poumons............................................................................ 128 3.2.3. Détection dans le sang .................................................................................... 129

3.3. Résultats de l’analyse sérologique......................................................................... 130 3.4. Résultats des analyses anatomopathologiques et immunohistochimiques ............ 130

3.4.1. Lésions anatomopathologiques....................................................................... 130 3.4.1.1. Lésions pulmonaires ................................................................................ 130 3.4.1.2. Lésions spléniques ................................................................................... 131

3.4.2. Résultats de l’analyse immunohistochimique................................................. 131 3.4.2.1. Analyses réalisées sur les poumons ......................................................... 131 3.4.2.2. Analyses réalisées sur les rates ................................................................ 132

3.5. Récapitulatifs des résultats .................................................................................... 133 4. DISCUSSION ................................................................................................................... 134

4.1. Le dispositif expérimental ...................................................................................... 135 4.2. L’infection par aérosols......................................................................................... 135 4.3. Influence de la taille de l’inoculum ....................................................................... 136 4.4. Influence de la souche de Coxiella burnetii........................................................... 137 4.5. Influence du sexe.................................................................................................... 138 4.6. Influence de l’immunocompétence......................................................................... 138 4.7. Perspectives ........................................................................................................... 139

4.7.1. Coxiella burnetii et le risque biologique naturel............................................. 139 4.7.2. Coxiella burnetii et le risque provoqué intentionnel....................................... 140

CONCLUSION ................................................................................................................... 142

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................................... 143

ANNEXES ........................................................................................................................... 154

5

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figures : Figure 1 : les différentes composantes de l’analyse de risque (Code zoosanitaire de l’Office

International des Epizooties)............................................................................................. 12 Figure 2 : les composantes de l’appréciation du risque .......................................................... 14 Figure 3 : représentation schématique des principales différences entre le danger biologique

et les dangers physique et chimique.................................................................................. 15 Figure 4 : les différents types de risques biologiques ............................................................. 16 Figure 5: l’abattoir de Brisbane en 1935................................................................................. 17 Figure 6 : Coxiella burnetii vue au microscope électronique à transmission : une paroi de

type Gram négatif ............................................................................................................. 18 Figure 7 : arbre phylogénétique montrant la relation entre Coxiella burnetii et les autres

espèces bactériennes appartenant aux Proteobacteria...................................................... 20 Figure 8 : courbe de l’épidémie de Chamonix selon la date du début des signes cliniques ... 39 Figure 9 : diversité des réservoirs et voies de transmission possibles de l’agent de la

fièvre Q ............................................................................................................................. 52 Figure 10: Coxiella burnetii mise en évidence par immunohistochimie à partir d’un

prélèvement valvulaire chez un patient atteint d’endocardite........................................... 63 Figure 11 : gabarit d’une attaque ponctuelle........................................................................... 94 Figure 12 : les différents niveaux de protection individuelle en images ................................ 96 Figure 13 : accords internationaux mis en œuvre pour le désarmement microbiologique ... 105 Figure 14: souris SCID mâles de 5 semaines........................................................................ 108 Figure 15: souris C57BL/6 mâles de 5 semaines.................................................................. 108 Figure 16: le dispositif d’hébergement des souris avant le début de l’étude ........................ 109 Figure 17: tenue de protection NSB 3................................................................................... 110 Figure 18 : plan illustré du L3............................................................................................... 110 Figure 19: le caisson à aérosols ............................................................................................ 112 Figure 20: schéma du caisson à aérosols .............................................................................. 113 Figure 21: dispositifs de contention des souris ..................................................................... 113 Figure 22 : la chambre de vaporisation avec ses 16 emplacements prévus pour les

animaux........................................................................................................................... 114 Figure 23: nébuliseur et extracteur permettant aux effluents d’être traités par filtration et

incinération ..................................................................................................................... 114 Figure 24 : le biocollecteur en phase liquide ........................................................................ 116 Figure 25 : répartition des prélèvements dans le temps........................................................ 117 Figure 26: les dispositifs de transfert des souris ................................................................... 118 Figure 27: fixation en croix d’une souris SCID et dissection du thorax en vue du prélèvement

du cœur et des poumons.................................................................................................. 118 Figure 28: principe de la sérologie par immunofluorescence indirecte................................ 119 Figure 29: principe du marquage de Coxiella burnetii par immunohistochimie .................. 120 Figure 30: mesure de la surface des coupes tissulaires par le logiciel SAMBA 2005.......... 121 Figure 31: principe de la nested PCR ................................................................................... 122 Figure 32: le Light Cycler..................................................................................................... 123 Figure 33: pièce dédiée au mélange des réactifs et boîte réfrigérée contenant les capillaires de

verre ................................................................................................................................ 123

6

Figure 34: mise en place des capillaires ............................................................................... 124 Figure 35: poids moléculaire des différentes bandes du marqueur VI et séparation des

produits de PCR sur gels d’agarose ................................................................................ 125 Figure 36: interprétation des gels après migration et illumination aux ultraviolets ............. 126 Figure 37: lésions pulmonaires visibles à J7......................................................................... 130 Figure 38: poumon normal (souris témoin) .......................................................................... 130 Figure 39: coupes de rate ...................................................................................................... 131 Figure 40: macrophages immunomarqués contenant Coxiella burnetii dans leurs

phagolysosomes. Lésions visibles sur les coupes réalisées à J7. .................................... 131 Figure 41: immunohistochimie réalisée sur les coupes de rate des souris exposées à aérosol 1

et sacrifiées à J14 ............................................................................................................ 132

Tableaux : Tableau I: caractéristiques des deux formes morphologiques de Coxiella burnetii ............... 19 Tableau II : les différents plasmides en fonction de la souche de Coxiella burnetii .............. 19 Tableau III : les phases antigéniques de Coxiella burnetii et leurs conséquences quant à

l’élaboration de vaccins .................................................................................................... 22 Tableau IV : foyers de fièvre Q répertoriés en Europe par l’OIE entre 1996 et 2001............ 27 Tableau V : nombre de cas humains déclarés à l’OIE entre 1996 et 2001 ............................. 35 Tableau VI : enquêtes menées en France sur la séroprévalence de Coxiella burnetii chez les

ruminants........................................................................................................................... 36 Tableau VII: seuils sérologiques pour le diagnostic de la fièvre Q en immunofluorescence

indirecte et par la réaction de fixation du complément..................................................... 65 Tableau VIII: exemples récents de bioterrorisme................................................................... 81 Tableau IX : activités et attentats perpétrés par la secte « Aum Shinrikyo » entre 1990 et

1995................................................................................................................................... 82 Tableau X : agents de programmes biologiques offensifs et agents associés à des biocrimes et

à du bioterrorisme ............................................................................................................. 82 Tableau XI : hypothèses de dissémination par avion de 50 kg d’agents sur une ligne de deux

kilomètres, au niveau d’une ville de 500 000 habitants.................................................... 90 Tableau XII : niveaux de protections individuelle et collective ............................................. 95 Tableau XIII : les différentes phases de la nested PCR........................................................ 124 Tableau XIV: récapitulatif des lésions macroscopiques observées lors du prélèvement des

organes ............................................................................................................................ 127 Tableau XV : résultats de la détection par LCN de Coxiella burnetii dans les poumons..... 128 Tableau XVI : résultats de la détection par LCN de Coxiella burnetii dans le sang ............ 129 Tableau XVII : moyennes et écarts-type du nombre de macrophages immunomarqués

par mm2 comptés chez les souris exposées à l’aérosol 1 et sacrifiées à J7 et J14 .......... 132 Tableau XVIII : récapitulatif des différents résultats obtenus .............................................. 133 Tableau XIX : caractéristiques des souches Nine Mile et Q212 .......................................... 137

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TABLE DES ANNEXES

Annexe 1 : coloration de Macchiavello ................................................................................ 155 Annexe 2: coloration de Stamp............................................................................................. 155 Annexe 3: coloration de Gimenez......................................................................................... 155 Annexe 4: maladies des listes A et B de l’OIE..................................................................... 156 Annexe 5: culture en tube « bijou » (ou en shell-vial).......................................................... 158 Annexe 6: la tenue de combat NBC à port permanent CE/OM............................................ 160 Annexe 7: la tenue légère de décontamination modèle 93 ................................................... 161 Annexe 8: recommandations relatives à la diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii

(plan Biotox) ................................................................................................................... 162 Annexe 9: technique utilisée pour la production des deux souches de Coxiella burnetii

phase I ............................................................................................................................. 165 Annexe 10: effet du temps d’exposition à l’aérosol (Mycobacterium smegmatis) sur la charge

bactérienne pulmonaire à J0............................................................................................ 166 Annexe 11: relation entre la taille de l’inoculum (Mycobacterium smegmatis) et la charge

bactérienne pulmonaire à J0............................................................................................ 166 Annexe 12: technique d’analyse sérologique mise en œuvre (immunofluorescence indirecte

semi-quantitative) ........................................................................................................... 167 Annexe 13: technique d’immunohistochimie (kits Histostain-Plus®, Rabbit primary (AEC)

(Zymed Laboratories Inc., CliniSciences, Montrouge, France)) .................................... 168 Annexe 14: technique d’extraction de l’ADN (QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN S.A.,

Courtaboeuf, France)) ..................................................................................................... 169 Annexe 15: séquence des amorces Sod 1 et 2 et des fragments qu’elles amplifient ............ 170 Annexe 16: réactifs utilisés pour la réaction de nested PCR (LightCycler FastStart DNA

Master SYBR Green I®, Roche Diagnostics, Meylan, France) ..................................... 171 Annexe 17: préparation des gels d’agarose à 2% et dépôt des échantillons......................... 171 Annexe 18: effets cytopathiques des souches Nine Mile et Q212........................................ 172

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LISTE DES ABREVIATIONS %G+C Pourcentage de guanine et de cytosine. ADCC Antibody Dependant Cell Cytotoxicity. AEC Amino Ethyl Carbazole. AMM Autorisation de Mise sur le Marché. ANPVP Appareil Normal de Protection à Vision Panoramique. ATCC American Type Culture Collection. ADIBIO Automate de Détection et d’Identification des Biocontaminants. ADN Acide désoxyribonucléique. ARN Acide ribonucléique. BCG Bacille de Calmette et Guérin (souche vaccinale). BET Bromure d’Ethydium. bioITMS Biological Ion Trap Mass Spectrometer. °C Degré Celsius. CDC Centers for Disease Control and prevention. CHU Centre Hospitalier Universitaire. CIA Central Intelligence Agency. CIEI Cellule Interrégionale d’Epidémiologie d’Intervention. CIRE Cellule Interrégionale d’Epidémiologie. cm Centimètre. CMR Chloroforme Méthanol Résidu. CMV Cytomégalovirus. CNR Centre National de Référence pour l’Etude des Rickettsioses. DDASS Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales. DDSV Direction Départementale des Services Vétérinaires. DGAL Direction Générale de l’Alimentation. EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétique. ELIFA Enzyme-linked Immunosorbent Fluorescence Assay. ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. ESB Encéphalopathie Spongiforme Bovine. FBI Federal Bureau of Investigation. FC Fixation du complément. FLAPS Fluorescent Aerodynamic Particle Sizer. γGT Gammaglutamyl transférase. g Gramme. h Heure. HPS Hématoxyline-Phloxine-Safran. IFI Immunofluorescence indirecte. IFN γ Interféron gamma. Ig Immunoglobuline (de type G, M, A). InVS Institut de Veille Sanitaire. J0 Jour de l’infection (deux heures après la fin de l’aérosol). J7 Septième jour post-exposition. J14 Quatorzième jour post-exposition. Kb Kilobase. KGB Komitet Gosudarstvennoi Bezopasnosti. km Kilomètre. L Litre.

9

L2 Laboratoire de biosécurité de niveau 2. L3 Laboratoire de biosécurité de niveau 3. LAPS Light Adressable Potentiometric Sensor. LCN Light Cycler nested PCR. LCR Liquide Céphalorachidien. LCV Large Cell Variant. LPS Lipopolysaccharide. MEM Minimal Essential Medium. mg Milligramme. MgCl2 Chlorure de magnésium. mg/L Milligramme par litre. min Minute. mL Millilitre. mol/L Mole par litre. µL Microlitre. µm Micromètre. NaH2PO4 Phosphate monosodique. Na2HPO4 Phosphate disodique. NBC Nucléaire Biologique et Chimique. OIE Office International des Epizooties. OMS Organisation Mondiale de la Santé. ONU Organisation des Nations Unies. OTA Office of Technology Assesment. Pa Pascal PAL Phosphatase alcaline. Pb Paires de bases. PBS Phosphate-Buffered Saline. PBS-BSA azide Phosphate-Buffered Saline-Bovine Serum Albumine (azide de

sodium). PCR Polymerase Chain Reaction. PSM Poste de Sécurité Microbiologique. s Seconde. S Svedberg. SAMU Service d’Aide Médicalisée d’Urgence. SCV Small Cell Variant. SIDA Syndrome d’Immunodéficience Acquise. SRAS Syndrome Respiratoire Aigu Sévère. T3P Tenue de Protection à Port Permanent. Taq polymérase Thermus aquaticus polymérase. TBE Tri Borate d’EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique) TNF Tumour Necrosis Factor. UNSCOM United Nations Special Commission (Commission Spéciale des

Nations Unies). URSS Union des Républiques Socialistes et Soviétiques. UV Rayons ultraviolets.

10

INTRODUCTION

La fièvre Q et son agent causal, Coxiella burnetii, ont été décrits et identifiés depuis plus d’un demi-siècle. Si cette maladie reste mal connue et suscite, chez les éleveurs d’animaux de rente, un intérêt limité dans la mesure où son impact économique est faible ; elle n’en demeure pas moins inscrite sur la liste B de l’Office International des Epizooties.

Par ailleurs, les récents évènements bioterroristes ont amené les Etats à prendre

conscience de la réalité du risque biologique provoqué intentionnel. Aussi, afin d’établir les mesures de protection et de prévention, la liste des agents biologiques pathogènes, dont la diffusion serait à craindre, a été dressée : Coxiella burnetii en fait partie.

La fièvre Q, maladie pratiquement inconnue du grand public, constituerait ainsi une

menace non seulement dans le cadre d’une infection strictement naturelle mais aussi dans le cadre d’une diffusion intentionnelle. Quelle est, en terme de gravité et de risque, la nature réelle de cette double menace ? Que doit-on réellement redouter d’une épidémie de fièvre Q ? Quels arguments pousseraient un terroriste à choisir Coxiella burnetii plutôt que Bacillus anthracis ?

Afin d’apporter des éléments de réponse à ces questions, nous avons étudié cette zoonose

sous ces deux angles de façon à élaborer le modèle expérimental animal le plus pertinent possible permettant de reproduire au mieux les effets biologiques d’une diffusion, intentionnelle ou non, de Coxiella burnetii. Ainsi, du 12 mai au 18 juillet 2003, nous avons exposé, dans un caisson étanche, plusieurs lots de souris à quatre aérosols infectieux contenant deux souches de Coxiella burnetii à deux concentrations différentes ; puis, nous avons prélevé différents organes et tissus (sang, poumon, cœur, foie, rate, cerveau) avant de procéder à leur analyse sérologique, anatomopathologique et immunohistochimique, que nous avons complétée par une détection de l’agent pathogène par Polymerase Chain Reaction.

11

1ère partie : Fièvre Q et risque biologique :

étude bibliographique

12

1. Le risque biologique : approche globale 1.1. L’analyse du risque biologique

1.1.1. La démarche (130)

L’analyse de risque, selon Ahl et Cerf, est définie comme une « démarche scientifique faite dans le but d’identifier les dangers connus ou potentiels, d’en apprécier les risques, de les gérer et de communiquer à leur propos. »

Figure 1 : les différentes composantes de l’analyse de risque (Code zoosanitaire de l’Office International des Epizooties (OIE)) (130). Définitions :

- le danger (« hazard ») : il correspond à une notion qualitative, et est constitué par « tout agent biologique, chimique ou physique pouvant avoir un effet néfaste sur la santé ». Il peut également correspondre à la maladie elle-même.

- le risque (« risk ») : il s’agit d’une notion quantitative qui correspond à la « probabilité de survenue d’un danger, combinée à l’importance de ses conséquences indésirables ».

Les composantes de l’analyse de risque :

l’identification des dangers : il s’agit de lister, de caractériser les dangers et en quelque sorte d’établir un scénario catastrophe. A chaque type de danger correspond une analyse de risque.

l’appréciation du risque : elle consiste, d’une part, en une estimation du risque et, d’autre part, en une évaluation de ce dernier, c’est-à-dire en une comparaison du niveau estimé avec le niveau jugé acceptable.

Pour estimer le risque, il est nécessaire de disposer de plusieurs informations : la probabilité d’émission : il s’agit de la probabilité d’émission dans l’environnement d’un agent pathogène à partir de la source soumise à l’analyse de risque. L’appréciation de l’émission consiste donc à décrire la séquence d’évènements nécessaires pour qu’une activité soit à l’origine de l’introduction de l’agent pathogène dans un milieu donné, et à estimer de façon qualitative et quantitative la probabilité de déroulement de l’ensemble de cette séquence.

la probabilité d’exposition : c’est la probabilité d’exposition des êtres vivants et de l’environnement à l’agent pathogène émis par la source soumise à l’analyse de risque. Là aussi, il faut décrire la séquence d’évènements nécessaires pour que des êtres vivants soient exposés au danger et estimer

Identification du danger

Appréciation du risque

Gestion du risque

COMMUNICATION RELATIVE AU RISQUE

13

qualitativement et quantitativement la probabilité de déroulement de l’ensemble de la séquence.

appréciation des conséquences sanitaires et économiques : il s’agit de décrire et de quantifier les effets néfastes associés à l’agent pathogène.

Il faut ensuite évaluer le risque, c’est-à-dire comparer le risque estimé avec le risque jugé acceptable, en vue d’accepter le risque considéré ou de mettre en place des mesures de diminution de ce risque. Si le risque acceptable correspond à un niveau de risque compatible avec la santé, compte tenu d’un ensemble de données épidémiologiques, sociales et économiques, sa détermination se heurte à de nombreuses difficultés : il peut être différent en fonction du type de population considérée (influence de facteurs médicaux, sociaux et culturels), il évolue dans le temps et sa perception reste subjective.

la gestion du risque : c’est un processus d’identification, de sélection et de mise en œuvre de mesures permettant de réduire le risque.

Elle se décompose en trois étapes : la définition des options de réduction du risque : on établit la liste de toutes les

méthodes permettant de contrôler le risque. l’estimation du risque réduit : il faut déterminer la probabilité de survenue du danger et de ses conséquences, une fois les options de réduction du risque mises en œuvre.

l’évaluation du risque réduit : on compare le risque réduit avec le risque initial et surtout avec le risque acceptable.

la communication relative au risque : elle correspond à un échange d’informations et d’opinions concernant le risque, entre les responsables de la gestion du risque et les autres parties intéressées telles que les milieux professionnels et publics. Il s’agit d’une étape importante qui peut également être un moyen de gestion du risque. En effet, l’information des populations à risque vis-à-vis d’un danger donné peut permettre de réduire ce risque. A contrario, l’effet inverse peut être observé ; ainsi, l’annonce de la dissémination d’un agent pathogène peut déclencher des mouvements de panique qui vont favoriser la transmission de celui-ci (si toutefois la contagion est directe).

14

Synthèse à partir de l’appréciation : Comparaison :

Figure 2 : les composantes de l’appréciation du risque (130).

1.1.2. Particularités du danger biologique (99)

Le danger biologique se distingue par de nombreux aspects des dangers physiques ou chimiques.

En effet, ces deux derniers dangers suivent une loi arithmétique : à une dose correspond un effet alors que le danger biologique est aléatoire et auto amplifié.

De plus, les effets visibles sont différés dans le temps du fait de l’existence d’une période d’incubation, ce qui génère des phénomènes de panique voire d’hystérie qui amplifient encore le problème épidémique ou épizootique.

Troisièmement, la détection du danger biologique est souvent difficile. En revanche, les agents pathogènes sont, la plupart du temps, beaucoup plus facilement

accessibles que les armes (armes conventionnelles, chimiques, composés radioactifs, …) dans la mesure où il s’agit souvent d’agents de zoonoses sévissant de façon enzootique dans certaines régions du monde.

Enfin, les moyens de lutte sont souvent plus limités face au danger biologique par rapport aux dangers physiques et chimiques vis-à-vis desquels on dispose de moyens de prévention et de riposte.

Appréciation du risque

Evaluation du risque Estimation du risque

Probabilitéd’émission

Probabilité d’exposition

Conséquences sanitaires et économiques

- du niveau de risque estimé - du niveau de risque jugé acceptable

Probabilité de survenue du danger

15

Figure 3 : représentation schématique des principales différences entre le danger biologique et les dangers physique et chimique (99).

L’analyse de risque, c’est identifier les dangers, apprécier leur gravité et leur risque de survenue, les gérer et communiquer à leur propos.

L’identification consiste à dresser la liste des dangers, l’appréciation passe par l’estimation du risque et sa comparaison avec le risque jugé acceptable. La gestion du risque suppose la mise en œuvre de mesures permettant de le réduire et la communication correspond à l’échange d’informations et d’opinions entre les responsables et les différentes parties concernées.

Le danger biologique comporte de nombreuses particularités dont il faut tenir compte dans l’analyse de risque : il ne suit pas la loi dose/effet, ses conséquences sont différées dans le temps, sa détection est difficile et les moyens de lutte sont limités.

Dangers physique et chimique

CIBLES

Absence de loi dose/effet

Invisible et différé

Loi dose/effet

Vulnérabilité Accès aisé

Détectabilité médiocre

Danger biologique

Visible et immédiat

Détectabilité satisfaisante

Accès difficile

VégétauxAnimaux

Homme

Impact économique

Impact médical

Retour d’expérience dans la gestion du risque

Absence de retour d’expérience dans la gestion du risque

16

1.2. Les différents risques biologiques (87)

Le risque biologique est défini comme étant la probabilité d’être exposé à un danger lié à la biologie. Il peut s’agir d’un risque macrobiologique (lié à l’action nuisible d’acariens, d’insectes, de rongeurs, pour exemples) ou d’un risque microbiologique où interviennent les virus, les bactéries, les parasites, les champignons, ou encore les prions.

On peut distinguer deux catégories de risques biologiques : d’une part, le risque naturel et, d’autre part, le risque provoqué.

Figure 4 : les différents types de risques biologiques (87). Il ne s’agit bien sûr que d’une certaine représentation de la réalité car le passage d’une catégorie à l’autre est permanent.

le risque naturel : le risque constant : il est la principale cause de décès par maladie infectieuse, on peut

citer, par exemple, la grippe, le SIDA, les diarrhées infantiles, la tuberculose ou encore le paludisme pour ce qui concerne les maladies humaines. Ce risque constant concerne aussi les différentes espèces animales et végétales.

le risque résurgent (ou réémergent) : on peut citer la diphtérie, à l’origine d’épidémies récentes en Russie, ou encore la peste dans la mesure où il existe un variant résistant à de nombreux antibiotiques. Ces deux exemples illustrent une résurgence qualitative car ces deux maladies avaient été éradiquées mais l’on peut avoir à faire face à une résurgence quantitative.

le risque émergent : il implique l’apparition, soit d’une maladie nouvelle c’est-à-dire d’un nouvel agent pathogène, soit l’émergence d’un agent pathogène vivant jusque-là dans un écosystème clos, soit d’une maladie encore inconnue donc non dépistée.

le risque provoqué :

le risque accidentel : il peut dépendre de facteurs très variés, on peut citer pour exemples les progrès médicaux qui ont révélé les infections nosocomiales, l’introduction des farines animales dans l’alimentation des bovins qui est responsable de l’Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB), ou la déforestation qui a permis le contact entre l’Homme et les virus des fièvres hémorragiques.

le risque intentionnel : il s’agit d’un chantage biologique. On peut distinguer différents niveaux de risque biologique intentionnel : à l’échelle des Etats, on parle de guerre biologique ; à l’échelle de groupuscules extrémistes, il s’agit de bioterrorisme et, à l’échelle individuelle, de biocriminalité.

RISQUE BIOLOGIQUE

NATUREL

Constant Intentionnel

PROVOQUE

AccidentelRésurgent Emergent

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La mortalité liée à ces différents types de risque est connue : elle se compte en millions pour ce qui relève du risque constant, en centaines de milliers pour le risque émergent, en dizaines de milliers pour le risque accidentel et en milliers pour le risque intentionnel. Le risque intentionnel peut ainsi apparaître comme étant dérisoire, cependant, il ne faut pas le négliger car il existe des passerelles entre ces risques et un risque constant peut être amorcé par le risque intentionnel.

Le risque biologique est la probabilité d’être exposé à un problème lié à la biologie. Celui-ci peut être naturel (constant, résurgent ou émergent) ou bien provoqué (accidentel ou intentionnel).

2. La fièvre Q et le risque biologique naturel 2.1. Historique

La fièvre Q a été décrite pour la première fois en 1935 par E.H. Derrick suite à une endémie d’épisodes fébriles chez des travailleurs de l’abattoir de Brisbane, en Australie (45). C’est alors qu’il baptisa cette nouvelle affection « Query fever », ce qui signifie « fièvre point d’interrogation » (82).

Figure 5: l’abattoir de Brisbane en 1935 (80).

En 1937, F.M. Burnet et M. Freeman isolèrent l’agent causal : une Rickettsie que Derrick

baptisa Rickettsia burneti. En 1938, G.E. Davis et H.R. Cox isolent dans le Montana une Rickettsie et la nomment Rickettsia diaporica en raison de son caractère filtrable. La même année, R.E. Dyer démontre l’identité de ces deux bactéries sur la base d’arguments sérologiques et cliniques. En 1942, Derrick et ses collaborateurs montrèrent l’existence de l’infection chez le bétail (82).

Pendant la seconde guerre mondiale, en 1941-1944, la maladie fût décrite chez des soldats allemands stationnés dans les Balkans, en Italie du Sud, en Corse, en Ukraine, en Crimée, et chez des troupes alliées anglaises et américaines en Italie centrale. C’est pourquoi la maladie connaît de nombreux synonymes : fièvre de l’Olympe, fièvre de Crimée, grippe balkanique, pneumonie de Crète, fièvre d’Eubée, du désert égyptien, d’Italie, fièvre des sept jours, ou encore maladie de Derrick et Burnet (60). En 1960, quelques cas sont signalés dans l’Est algérien au cours de la guerre d’indépendance (60).

18

En 1948, C.B. Philip proposa la création d’un nouveau genre en raison du mode de transmission de la bactérie qui n’implique pas obligatoirement les arthropodes et renomma l’agent de la fièvre Q Coxiella burnetii en hommage à Burnet et Cox (82).

En France, la maladie a été observée pour la première fois en 1948 à Strasbourg chez des ouvriers d’abattoir (79). En 1949, 1951 et 1955, des cas furent signalés à Paris et dans la région de Lyon. En 1953, deux épidémies dues à l’inhalation de poussières infectées sont observées dans les centres de tri postal de Moulins et Montluçon (53). Depuis, la fièvre Q a été décrite dans le monde entier excepté en Nouvelle Zélande (85).

2.2. Etude de l’agent 2.2.1. Morphologie

Figure 6 : Coxiella burnetii vue au microscope électronique à transmission : une paroi de type Gram négatif. Grossissement x75 000 (45).

Coxiella burnetii est une bactérie aérobie stricte (34), immobile (134), intracellulaire stricte, de petite taille (0,2 à 0,4 µm de large sur 0,4 à 1 µm de long) (60). Son entrée dans les cellules hôtes se fait de façon passive (80) par phagocytose puis elle survit dans les phagolysosomes des macrophages où le pH est compris entre 4,7 et 5,2 (83, 117). Cette survie est possible car Coxiella burnetii est capable de bloquer le métabolisme oxydatif des macrophages et de synthétiser ses propres enzymes dégradant les substances oxydantes (134).

Bien que sa paroi ait les caractéristiques de celle d’une bactérie à Gram négatif, cette coloration est inutilisable. Pour mettre en évidence Coxiella burnetii, on a recours aux colorations de Machiavello, de Stamp ou de Gimenez (annexes 1, 2 et 3) (60).

Le cycle de développement de Coxiella burnetii est double : on observe d’une part une multiplication par fission binaire et d’autre part, un phénomène de division asymétrique qui conduit à la formation d’une pseudo-spore. Ceci explique le caractère pléomorphe de la bactérie qui peut apparaître sous une forme Small Cell Variant (SCV), de petite taille (0,2-

19

0,5µm), métaboliquement inactive mais très résistante ou sous une forme Large Cell Variant (LCV), de taille supérieure à 1µm, métaboliquement très active mais très fragile en dehors du milieu intracellulaire (90). Ces deux variants cellulaires ont un pouvoir infectieux que ce soit in vitro ou in vivo (90).

Tableau I: caractéristiques des deux formes morphologiques de Coxiella burnetii.

Morphologie Small Cell Variant Large Cell Variant Multiplication division asymétrique division binaire

Taille 0,2-0,5 µm > 1 µm Résistance élevée très faible

Métabolisme très faible intense Pouvoir infectieux oui oui

Il existe de nombreuses souches de Coxiella burnetii présentant des variations génétiques portant à la fois sur l'ADN chromosomique et sur l'ADN plasmidique (de nombreuses souches renferment des plasmides présents en 1 à 4 exemplaires). Le chromosome est certainement linéaire et, selon les souches, sa taille est comprise entre 1,5 et 2,4 X 106 paires de bases. L'analyse des profils de restriction de l'ADN permet de reconnaître 6 groupes génomiques (groupes I à VI).

Les souches des groupes génomiques I, II et III renferment un plasmide de 36 Kb (plasmide QpH1), les souches du groupe génomique IV possèdent un plasmide de 39 Kb (plasmide QpRS) et les souches du groupe génomique VI un plasmide de 42 Kb (plasmide QpDG). Un plasmide de 33 Kb, baptisé QpDV, a également été identifié dans une souche d'origine française. Les souches du groupe génomique V sont dépourvues de plasmide libre mais leur chromosome intègre des séquences analogues au plasmide QpRS (38).

Des études comparatives ont été menées sur la séquence du plasmide QpH1 présent chez Coxiella burnetii en phase I et II, et sur les séquences plasmidiques intégrées au chromosome sur les souches du groupe V en phase I et II : elles révèlent que la variation de phase n’est pas corrélée à l’existence d’une séquence ou d’un gène spécifiques (90).

Par ailleurs, certaines études avaient établi une corrélation entre la diversité génétique des souches et leur pouvoir pathogène (41, 110, 122). Les souches des groupes I, II et III semblaient responsables d'infections aiguës chez l'Homme, les souches des groupes IV et V d'infections chroniques (endocardites) et les souches du groupe VI d'un pouvoir pathogène non documenté (ces souches ont été isolées uniquement de rongeurs dans l'Utah).

Ultérieurement, des études portant sur un nombre de souches plus important n'ont pas permis de confirmer ces données et les variations génétiques semblent en rapport avec l'origine géographique des souches mais non avec leur pouvoir pathogène (38).

Tableau II : les différents plasmides en fonction de la souche de Coxiella burnetii.

Souche (groupe génomique) Présence d’un plasmide Taille du plasmide

I, II, III Plasmide QpH1 36 Kb IV Plasmide QpRS 39 Kb

V Absence de plasmide libre mais intégration de la séquence de QpRS dans le chromosome

20

2.2.2. Classification

Coxiella burnetii n’étant pas cultivable sur un milieu axénique et ayant longtemps été isolée à partir de tiques, elle a été classée dans l’ordre des Rickettsiales, famille des Rickettsiaceae, tribu des Rickettsiae (avec les genres Rickettsia et Rochalimaea). Cependant, de récentes études phylogénétiques, basées sur l’étude de la séquence de l’ARN ribosomal 16S, ont montré que le genre Coxiella appartient à la subdivision gamma des Proteobacteria et est proche des genres Legionella, Francisella et Rickettsiella (45) alors que le genre Rickettsia appartient au sous-groupe alpha-1 et le genre Rochalimaea au sous-groupe alpha-2 des Proteobacteria (83).

Figure 7 : arbre phylogénétique montrant la relation entre Coxiella burnetii et les autres espèces bactériennes appartenant aux Proteobacteria (83).

Proteobacteria Groupes

Francisella tularensis Coxiella burnetii

Legionella pneumophila

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Rickettsia rickettsii

Ehrlichia chafeensis

Bartonella henselaeBrucella melitensis

Afipia felis

Campylobacter jejuni

gamma

delta

alpha

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2.2.3. Résistance

C’est la forme pseudo-sporulée qui confère à Coxiella burnetii sa longue survie dans le milieu extérieur : plus de 5 mois dans le sol (134), 4 à 6 mois dans le sang séché (88), jusqu’à deux ans dans les déjections de tiques (96), 50 jours dans l’urine desséchée, 30 jours dans le lait desséché (30) et dans la viande (112).

Coxiella burnetii présente également une grande résistance aux agents physico-chimiques : elle survit une heure à 60°C dans le lait, 30 minutes à 63°C, 15 secondes à 70°C et deux ans à -20°C (30). Elle résiste également aux désinfectants usuels aux concentrations habituelles (formol à 0,5%, phénol à 1%, hypochlorite à 0,5% (115), ammoniums quaternaires).

Elle est néanmoins détruite par l’acide chlorhydrique à 0,5%, la chaux chlorée à 2%, l’éther, le formol à 1% (25), l’eau oxygénée à 5% (92), l’eau de Javel entre 1 et 2% (20) et par les traitements de pasteurisation (62,8°C pendant 30 minutes ou 71,7°C pendant 15 secondes) (20, 88).

2.2.4. Propriétés immunologiques

2.2.4.1. Deux variations de phase

On connaît deux phases antigéniques chez Coxiella burnetii, liées à la structure du lipopolysaccharide (LPS) de surface et similaires aux variations Rough/Smooth observées au sein des Enterobacteriaceae.

La phase I (correspondant à la phase Smooth) est la forme infectieuse, isolée chez l’animal, vertébré ou arthropode, alors que la phase II est obtenue in vitro à partir de la phase I après passages sur œufs embryonnés ou sur culture cellulaire. Son pouvoir infectieux est faible. Le passage à la phase II est en fait la conséquence d’une délétion chromosomique spontanée (117). La réversion vers la phase I de ce mutant est donc impossible par inoculation sur animal sensible bien que cela ait été longtemps suggéré (88). En fait, il est probable qu’au sein d’une population bactérienne majoritairement de phase II, il persiste quelques individus de phase I et que ces derniers soient sélectionnés suite à l’inoculation à l’animal (117).

La phase II se multiplie rapidement in vitro alors qu’in vivo, elle est sensible à l’action du complément et est éliminée (117). A l’inverse, la phase I est insensible à l’action du complément par absence de fixation de la fraction C3b, grâce à la conformation du LPS (117). Cette conformation particulière bloque également stériquement l’accès des anticorps aux protéines de surface. Cela pourrait expliquer (au moins en partie) pourquoi la bactérie persiste de façon cryptique dans l’organisme après un épisode aigu alors que l’individu reste séropositif toute sa vie (45).

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Tableau III : les phases antigéniques de Coxiella burnetii et leurs conséquences quant à l’élaboration de vaccins.

Phase antigénique Phase I Phase II Correspondance chez les

Entérobactéries Phase Smooth Phase Rough

Elimination par l’hôte difficile Rapide

Obtention IN VIVO

Forme infectieuse isolée chez tous les animaux

IN VITRO Forme obtenue sur œuf

embryonné ou sur culture cellulaire

Utilisation sous forme vaccinale Chez l’Homme Chez l’animal

Efficacité du vaccin 100 à 300 fois supérieure au vaccin phase II Mauvaise

Durée de la protection Au moins 5 ans 2 à 6 mois environ

2.2.4.2. Pouvoir immunigène

L’infection par Coxiella burnetii provoque chez l’hôte à la fois une réponse immunitaire à médiation humorale et cellulaire.

- immunité humorale et rôle des anticorps :

La phase I provoque la formation, chez l’hôte, d’anticorps anti-phase I et anti-phase II alors que la phase II n’entraîne la formation que d’anticorps anti-phase II (82). Le rôle des anticorps dans la lutte contre l’infection est encore mal connu mais il semble qu’ils accélèrent l’élimination de la bactérie en activant l’immunité cellulaire dont les macrophages (90, 134). En effet, les cellules infectées par Coxiella burnetii seraient détectées et lysées par le mécanisme de cytotoxicité cellulaire dépendant des anticorps (ADCC). Les bactéries ainsi vulnérables seraient phagocytées par les macrophages activés. Le niveau d’expression des antigènes bactériens à la surface des cellules infectées semble donc être un facteur déterminant quant à la persistance de l’infection (134).

- immunité cellulaire :

Le rôle central de l’immunité cellulaire a été démontré chez la souris : une souris normale élimine Coxiella burnetii au bout de 14 jours en moyenne alors qu’une souris athymique l’élimine en minimum 60 jours et ce, malgré la production d’anticorps (64). L’élimination de l’agent pathogène dépend de l’intensité de la réponse de type Th1 chez l’hôte : plus celle-ci est importante, meilleure est l’élimination (90). Les lymphocytes T sensibilisés sécrètent des lymphokines (comme l’interleukine 1, l’interleukine 12, le Tumour Necrosis Factor (TNF) et l’interféron γ (IFN γ)) qui activent les macrophages. Ces derniers, ainsi activés, inhibent alors la réplication de la bactérie (90). Cependant, la phase I de Coxiella burnetii est capable de stimuler son internalisation dans les macrophages et de diminuer leur réponse aux cytokines (notamment l’IFN γ). La réponse à médiation cellulaire est alors insuffisante pour éliminer l’agent pathogène (90).

23

Coxiella burnetii est une bactérie Gram négatif classée dans le sous-groupe gamma des Proteobacteria. Il s’agit d’une bactérie de petite taille, intracellulaire stricte et capable de survivre dans les phagolysosomes des macrophages.

Elle a un aspect polymorphe : on observe des formes SCV (pseudo-spores, très résistantes dans le milieu extérieur et à de nombreux agents physico-chimiques) et des formes LCV (végétatives), toutes deux infectieuses.

Il existe de nombreuses souches présentant des variations chromosomiques et plasmidiques en relation avec leur origine géographique mais sans rapport avec leur pouvoir pathogène.

Coxiella burnetii se présente également sous deux formes antigéniques : la phase I, infectieuse, isolée chez l’animal et l’Homme et la phase II, avirulente, obtenue après passages sur culture cellulaire ou sur œuf embryonné.

L’infection provoque chez l’hôte une synthèse d’anticorps ainsi qu’une réponse immunitaire à médiation cellulaire. L’intensité de la réponse cellulaire de type Th1 conditionne directement l’élimination de la bactérie.

2.3. Epidémiologie

La fièvre Q est une maladie largement ubiquiste qui touche un grand nombre d’espèces dont l’Homme. Son incidence est mal connue et sans doute sous-estimée (128).

2.3.1. Epidémiologie descriptive

2.3.1.1. Répartition temporelle

2.3.1.1.1. Caractère épidémique

Chez l’animal, la maladie sévit avec un caractère enzootique lorsqu’on se place à l’échelle du troupeau (l’individu étant l’unité épidémiologique). En effet, en France, l'infection semble sévir sur l'ensemble du territoire et, selon les régions, le pourcentage d'infection des ovins varie de 0,3 à 39, celui des caprins de 0 à plus de cinq et celui des bovins de 1,8 à 12,3 (38). Si l’on considère le troupeau comme unité épidémiologique, l’infection est plutôt sporadique voire enzootique selon les pays (34).

Chez l’Homme, la fièvre Q sévit sous la forme de cas sporadiques avec des zones d’endémies. De nombreuses épidémies, généralement limitées ont été rapportées (128). La fièvre Q a été mise en évidence dans toutes les régions du monde où elle a été recherchée avec des zones d’endémies faibles ou fortes, dans lesquelles surviennent des cas sporadiques ou des épidémies explosives et autolimitées. Le seul pays apparemment indemne est la Nouvelle Zélande (117).

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2.3.1.1.2. Caractère saisonnier

Dans les troupeaux, la contamination est souvent soumise à un rythme saisonnier car elle a lieu spécialement en période de mises bas où un grand nombre de bactéries sont excrétées dans l’environnement par les femelles infectées (115, 117). On constate un caractère cyclique de la maladie, en particulier chez les chèvres, estimé à 4-5 ans, ce qui pourrait représenter l’espace de temps nécessaire pour la restauration de la sensibilité du troupeau à l’infection (36). Lors de l’introduction de la bactérie dans un troupeau, 10 à 25% des femelles gestantes avortent, qu’elles soient primipares ou non. Puis, les avortements diminuent (ils deviennent inférieurs à 5% des femelles gravides) mais, les nouveau-nés sont chétifs même s’ils naissent à terme. La nouvelle vague d’avortements qui survient ensuite n’atteint que les primipares (112).

Chez l’Homme, la plupart des cas de fièvre Q aiguë surviennent en mars, avril, mai et juin, coïncidant avec la saison d’agnelage : la contamination de l’environnement est alors maximale dans les zones d’enzooties (116, 128). Une autre explication peut être avancée pour expliquer le pic de printemps ; il s’agit de l’augmentation des abattages d’agneaux à l’occasion des fêtes de Pâques et de l’Aïd-el-Khebir, lors de laquelle, notamment, un certain nombre d’abattages se pratiquent en dehors des abattoirs dans des conditions qui favorisent la contamination (129). De plus, le vent, fort à cette époque de l’année, propage les aérosols infectieux des zones d’élevages vers les populations urbaines (117).

Chez l’animal, la maladie est enzootique ; elle suit néanmoins le rythme saisonnier des mises bas.

Chez l’Homme, elle est plutôt sporadique avec des zones d’endémies et des flambées épidémiques limitées, souvent en relation avec la saison (de mars à juin).

2.3.1.2. Répartition géographique

2.3.1.2.1. Dans le monde

En 1955, la fièvre Q avait été identifiée dans 51 pays répartis sur les cinq continents (61, 90). En 1990, la maladie s’était étendue au Nigeria, en Tanzanie, en Arabie Saoudite, en Colombie, en Uruguay, en Finlande, en Irlande et en ex-Tchécoslovaquie (61). Aujourd’hui, sa répartition est mondiale (117), elle a été mise en évidence dans toutes les régions où elle a été recherchée : sa distribution géographique semble donc suivre celle des rickettsiologues (128). Seule la Nouvelle Zélande serait épargnée (54, 77, 90).

Elle est inscrite sur la liste B de l’OIE (annexe 4).

chez l’animal : Les données épidémiologiques sur la répartition et la prévalence de la fièvre Q chez

l’animal sont rares, dénotant le faible intérêt porté à la maladie animale du fait de sa faible incidence économique chez les animaux de rente. De plus, la multiplicité des réservoirs animaux complexifie encore la tâche.

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Sur le continent américain Au Canada, les bovins restent le réservoir majeur (117) : en Ontario, 67% du cheptel

bovin est séropositif (34). Cependant, les chats et les chiens sont un réservoir non négligeable dans les zones urbaines : 6 à 20% des chats sont séropositifs (34).

Aux Etats-Unis d’Amérique, les sources sont des animaux sauvages tels que le Coyote et le Renard gris, puis l’élevage caprin à partir des années 1970 (34). En 1980, 66% des chiens de Californie (23), 9% des chats, 32% des troupeaux de bovins et 26% des chevaux étaient séropositifs (34). En Afrique

En ce qui concerne les animaux de rente, le Niger et la Tunisie ont des cas sporadiques aussi bien chez les bovins que chez les ovins et caprins. L’Algérie est touchée mais la fréquence de l’infection est inconnue. L’Afrique du Sud et le Sénégal déclarent des cas sporadiques, tandis que la Libye, le Kenya et le Nigeria n’ont pas déclaré de cas à l’OIE en 1995. Aucun cas n’a jamais été constaté au Maroc, en Egypte, au Soudan et en République Centrafricaine (34).

Concernant le chien, au Nigeria, la séroprévalence est de 29% (sur 786 chiens testés) (23). Au Sénégal, une étude de séroprévalence portant sur des chiens militaires traités préventivement contre l’ehrlichiose (250 mg de chlorhydrate de tétracycline par jour pendant 8 jours) a montré que tous les chiens testés étaient séronégatifs pour Coxiella burnetii (23). En Océanie

L’Australie et plus particulièrement le Queensland, berceau de la fièvre Q, ainsi que le Centre et l’Est sont touchés, du fait de la forte concentration des élevages. Les bovins sont la source principale de la contamination humaine, cependant, les ovins, les caprins et surtout la faune sauvage sont des vecteurs non négligeables (34). En Asie

L’Asie est une zone d’enzootie par le biais des élevages d’ovins en particulier (34), à quelques exceptions près : au Japon, les bovins représentent le réservoir majeur (117) et la séroprévalence chez le chien est de 15% (sur 632 chiens testés) (23) ; en Inde, une étude a montré que 6% des volailles domestiques étaient séropositives et que le taux de séropositivité du personnel s’élevait à 27,52% (126) ; en Russie, il existe des foyers d’enzooties dans les grandes régions d’élevages ovins et bovins et dans les zones d’implantation des industries de la filière volailles (90). Au Moyen Orient

La Turquie, l’Iran, Israël sont des zones d’enzooties par le biais de l’élevage extensif des petits ruminants et particulièrement des ovins mais aussi des bovins, notamment en Israël (34). En Europe

Dans le Sud, toute la zone circum-méditerranéenne est une zone enzootique (34). L’Italie est contaminée par les lièvres et les ovins chez qui la séroprévalence est élevée (12 à 55%) (83, 127), par contre, chez le chien, la séroprévalence est faible : elle a été estimée à 1% (sur 802 chiens testés) dans le Nord du pays (23). En Grèce, le réservoir principal est constitué par les petits ruminants (34). A Chypre, quelques foyers se déclarent régulièrement chez les petits ruminants (7).

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En Bulgarie, la maladie touche à la fois les ruminants domestiques (surtout les caprins (90, 117)) et sauvages. En Croatie, les ruminants domestiques sont infectés (7) et la séroprévalence chez les chiens, dans le Sud du pays, est de 12% (sur 51 chiens testés) (23). En Bosnie-Herzégovine, 204 foyers bovins ont été déclarés en 2001 (7). Le Portugal n’a, en revanche, pas déclaré de cas depuis 1995 (34).

Dans le Nord, la Suède et la Pologne ont eu des cas sporadiques en 1995 chez les ovins et les bovins (34). En 1996, la Pologne a déclaré huit foyers touchant les bovins (7).

Dans l’Ouest, la maladie existe, en Suisse, chez les ovins (38% de séroprévalence (34), cinq foyers en 2001 (7)), les bovins (69 foyers déclarés en 1995 (34), 26 en 2001 (7)), les caprins (quatre foyers déclarés en 2001 (7)) et les chiens (31% de séroprévalence sur 388 tests) (23). En Allemagne, on a recensé 71 troupeaux atteints par an entre 1971 et 1979, 328 par an entre 1980 et 1989, et 303 par an entre 1990 et 1998. Ces tests ont été effectués pour la plupart sur des bovins destinés à l’abattoir ou dont le lait est consommé cru ou encore de façon sporadique dans des cheptels frappés par une recrudescence du taux d’avortements ou d’infertilité (56). En 1998, un sondage réalisé dans 13 des 16 laboratoires vétérinaires d’Etat a montré que 7,8% des 21 191 bovins testés, 1,3% des 1 346 moutons testés et 2,5% des 278 chèvres testées étaient infectés par Coxiella burnetii (56). Les études menées chez les bovins dans le Sud du pays montrent que la séroprévalence est restée quasi-constante depuis les années 1950 ; alors que dans le Nord (Hesse, Westphalie, Basse Saxe), la séroprévalence, faible dans les années 1950 et 1960, est devenue comparable à celle du Sud du pays dans les années 1980 et 1990. Dans les troupeaux où l’on observe des avortements et des problèmes d’infertilité, la séroprévalence peut atteindre 75%. Chez les ovins, la séroprévalence est en général plus faible que chez les bovins. Ceci est sans doute en partie dû à la persistance plus longue des anticorps chez les bovins. Cependant, lors d’une épidémie humaine, la séroprévalence dans les troupeaux ovins incriminés est très élevée, reflétant plutôt une infection récente (56). L’infection à Coxiella burnetii ne concerne pas exclusivement le bétail mais est également présente chez les animaux familiers comme le chien, chez lequel on a mesuré une séroprévalence de 3% (sur 1620 chiens testés) (23). Aux Pays-Bas, les données concernent surtout les animaux domestiques parmi lesquels, on recense 13,2% (91/688) de séropositivité chez les chiens et 10,4% (46/441) chez les chats (37). Au Royaume-Uni, la fièvre Q est enzootique chez les ovins et les bovins (90). C’est dans le Sud-Ouest du pays que se situe le plus grand effectif ovin, et c’est de façon concomitante cette zone qui est la plus touchée. Néanmoins, les rats semblent être un second réservoir important (83). En 1996, un tiers des avortements analysés chez les bovins étaient dus à Coxiella burnetii, et, en 1999, 21% de séropositifs ont été recensés (34). En 2001, le nombre de cas de fièvre Q chez les ruminants domestiques a significativement diminué ; ceci est sans aucun doute à mettre en relation avec l’enzootie de fièvre aphteuse (86). Enfin, en Irlande du Nord, le nombre de cas humains augmente depuis les années 1980, parallèlement à l'accroissement du cheptel ovin (34).

Dans le Centre, en Autriche, la maladie est décrite chez les animaux sauvages et domestiques. La Hongrie et la République Tchèque ont déclaré des cas sporadiques sur des bovins mais n’ont jamais constaté de petits ruminants infectés. En revanche, la Slovaquie a décelé des ovins mais aussi des bovins séropositifs (34).

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Tableau IV : foyers de fièvre Q répertoriés en Europe par l’OIE* entre 1996 et 2001 (7).

Nombre de foyers Pays Espèces

infectées En 2001 En 2000 En 1999 En 1998 En 1997 En 1996

bovins 79 113 132 217 187 caprins 1 1 3 1 Allemagne ovins 7 6 7 3 6

Bosnie-Herzégovine bovins 204 bovins 16 1 11 57 16 caprins 5 2 11 9 Bulgarie ovins 3 2 2 52 30

caprins 1 1 2 3 Chypre

ovins 4 1 2 bovins 1 3 3 2 ovins 6 1 7 Croatie

caprins 4 2 Grèce ovins / caprins 28 1 2 2 12

bovins 1 1 Italie

ovins 1 Pologne bovins 8

Serbie/Monténégro ovins 5 bovins 2 2 5 1

Slovaquie ovins 1

Slovénie bovins 1 bovins 26 38 37 34 29 45 caprins 4 1 2 3 2 Suisse ovins 5 2 4 6 1

*OIE : Office International des Epizooties.

chez l’Homme : L’épidémiologie de la fièvre Q a été beaucoup plus documentée que chez l’animal, même

si de nombreuses questions restent encore en suspens. Sur le continent américain Au Canada :

Dans le Centre et l’Est, des enquêtes séroépidémiologiques ont montré une forte prévalence chez les donneurs de sang alors qu’aucun cas clinique n’a jamais été rapporté dans le Centre et seuls quelques cas sporadiques de pneumonies ont été décrits dans l’Est (36, 90).

En Nouvelle Ecosse, le premier cas rapporté date de 1981. Puis, 174 cas ont été rapportés de 1980 à 1987 : les hommes de 29 à 49 ans semblent être la catégorie la plus touchée. La majorité des contaminations récemment rapportées sont liées à un contact avec des chattes

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parturientes. D’autres contacts animaux (chiens, lièvres, cervidés) ont également été retrouvés comme facteurs de risque. 11 cas d’endocardite ont été diagnostiqués entre 1979 et 1993, soit une incidence de 0,73 par million d’habitants et par an. Coxiella burnetii est l’agent étiologique d’environ 3% de l’ensemble des cas d’endocardite et de 2,7% des cas de pneumopathie atypique (troisième cause, avant l’apparition du SRAS en 2003) dans cette province du Canada (83). Récemment, la séroprévalence a été estimée à 14,6% (1).

Dans la province de Terre-Neuve, au printemps 1999, une enquête épidémiologique, réalisée lors d’une épidémie de fièvre Q survenue dans une région rurale, a montré que les facteurs de risque étaient le contact avec le placenta des chèvres, le tabagisme et la consommation de fromage de chèvre (produit à partir de lait pasteurisé) (55). Aux Etats-Unis d’Amérique :

La prévalence de l’infection humaine est mal connue. Les premières grandes épidémies ont été rapportées en 1946 dans les abattoirs d’Amarillo (Texas) et de Chicago (Illinois). Les études menées entre 1947 et 1950 ont démontré que la Californie était une zone d’endémie de la fièvre Q (83). Entre 1948 et 1977, 1169 cas de fièvre Q ont été déclarés aux Centers for Disease Control (CDC) avec, en moyenne, 39 cas par an et des pics à plus de 100 cas en 1953 et 1954. 67% de ces cas proviennent de Californie (128). Moins de 30 cas annuels ont été rapportés entre 1978 et 1986 (83) et très peu de cas d’endocardite ont été décrits (61).

Le chat semble être un réservoir non négligeable sur le continent américain. En effet, en Californie, 9 à 20% des chats mis en fourrière sont séropositifs (40).

En 1991, dans l’Est du Maine, à Goldsboro, 15 personnes d’une même famille ont contracté la fièvre Q aiguë alors qu’ils avaient été exposés, deux semaines auparavant, à une chatte qui mettait bas. Parmi ces 15 personnes, 11 ont présenté des signes cliniques (83, 94). Il est intéressant de noter que ce foyer familial est survenu dans le Maine, un Etat proche des provinces maritimes du Canada où la plupart des épidémies rapportées sont liées aux chats (83). Depuis 1999, et en raison de son utilisation potentielle dans le cadre du bioterrorisme, la fièvre Q est une maladie à déclaration obligatoire aux Etats-Unis. Les CDC ont reçu 48 déclarations en 2000 et 2001. Une publication récente décrit l’investigation de six cas en Californie, Georgie, Pennsylvanie et Tennessee, et remet en évidence le rôle du contact (direct ou indirect) avec le bétail dans la transmission (127). En Guyane :

Des sérologies positives de fièvre Q ont été rapportées pour la première fois en 1955. Depuis, des cas sporadiques sont régulièrement diagnostiqués sans que cette maladie représente un problème important sauf en 1996, où de nombreux cas ont été recensés. Ces cas étaient bénins sauf pour trois patients qui ont dû être hospitalisés en soins intensifs pour syndrome de détresse respiratoire aiguë. Un patient est décédé. L’enquête séroépidémiologique qui a suivi, a confirmé l’augmentation de l’incidence de la fièvre Q dans le département et plus particulièrement à Cayenne (47) : 26 cas pour 100 000 habitants en 1996 et 37 cas pour 100 000 habitants et par an entre 1997 et 2000 (25). L’origine de la contamination n’a pas été complètement élucidée mais tous les facteurs de risques habituels lors d’épidémies de fièvre Q ont été écartés et il semble qu’un réservoir animal sauvage dont l’activité augmente lors de la saison humide et /ou l’urbanisation sont des facteurs de risques avérés (25, 49).

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En Afrique En Afrique du Nord :

La séroprévalence dans les pays du Maghreb est comparable à celle retrouvée dans les pays d’Europe du Sud. Au Maroc, la séroprévalence a été mesurée à 1% parmi 300 donneurs de sang de Casablanca et de 18,3% sur 126 sérums provenant de laboratoires d’analyses médicales de Fez. En Tunisie, la séroprévalence est élevée (26%) chez les donneurs de sang (127). En Afrique de l’Ouest :

En Afrique de l’Ouest, comme dans toute l’Afrique sub-saharienne, les séroprévalences sont variables, avec une corrélation géographique avec les zones d’élevage. En Mauritanie, 33% sur 118 sérums prélevés sur des patients hospitalisés se sont révélés positifs. Au Togo, 559 sérums ont été étudiés en micro-agglutination, montrant une séroprévalence de 2%, principalement au Nord du pays (127). Plusieurs études ont été réalisées au Nigeria : la première montrait une séropositivité de 63% sur 176 sérums (127), la deuxième, 44% sur 75 patients (61). Au Niger, une étude a été réalisée en 1994 chez des enfants de moins de cinq ans, montrant une séroprévalence de 9,6%, corrélée avec un contact avec les animaux (127). Enfin, au Cap Vert, 316 sérums ont été prélevés à la suite d’une épidémie d’épisodes fébriles compatibles avec la fièvre Q, et 41,7% étaient positifs. Des travaux ultérieurs ont confirmé la forte séroprévalence (plus de 80%) de la fièvre Q au Cap Vert (127). En Afrique Centrale :

Peu de travaux ont été réalisés dans les pays d’Afrique Centrale. En 1995, la séroprévalence en République Centrafricaine était de 9,1% (127). En Afrique de l’Est :

Une importante étude a été menée en Egypte, montrant une séroprévalence chez les donneurs de sang de 20% dans la région du Canal de Suez (sur 358 tests), de 16% dans la Vallée du Nil (sur 501 tests) et 10% dans le delta du Nil (sur 427 tests), et de 25% chez des éleveurs (sur 71 tests). Chez des patients adultes fébriles, la prévalence était de 28% sur des sérums précoces, avec 12% de séroconversion sur un deuxième sérum. Après une épidémie de fièvre au Nord du Soudan, des IgG dirigés contre Coxiella burnetii étaient retrouvés chez 54% de 185 sujets fébriles et 53% de 186 sujets asymptomatiques. Des IgM étaient retrouvées chez 29% des patients fébriles et 15% des sujets apyrétiques. En Ethiopie, 465 travailleurs des abattoirs d’Addis-Abeba ont été testés en 1988, montrant une séroprévalence de 6,5%. En Tanzanie, un travail sur 150 femmes enceintes de Dar-es-Salaam a montré une séroprévalence de 4,7%. Une étude sur un camp de réfugiés somaliens à Djibouti a permis d’évaluer la séroprévalence en octobre 1991 et en mai 1992. Lors du premier passage, 25,4% des sujets étaient positifs vis-à-vis de Coxiella burnetii et 11,9% ont présenté une séroconversion lors du deuxième passage. Au Kenya, une micro-épidémie a été rapportée récemment chez des touristes ayant effectué un safari dans la réserve Masai Mara. Deux cas symptomatiques se sont déclarés, leur seule activité commune avait été la visite d’une hutte en paille dans laquelle ils ont vu des chèvres (127).

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En Afrique Australe : En Zambie, une étude a été menée sur 377 sérums, montrant une séroprévalence globale

de 8,2%. Cette séroprévalence était plus élevée dans les régions de l’Est (11,8%) et de l’Ouest (7,4%) du pays qu’au Nord (3%), corrélée avec les zones d’élevage (127).

D’importants travaux ont été menés au Zimbabwe et en Afrique du Sud. Au Zimbabwe, sur 494 sérums testés, la séroprévalence était de 37%, sans particularité en terme d’âge et de sexe (1, 61, 127). La même équipe a démontré que les chats étaient une source d’infection potentielle au Zimbabwe (13% de positifs) et en Afrique du Sud (2% de positifs), comme dans les pays industrialisés (127). En Océanie En Australie :

Depuis la description de la maladie par Derrick en 1937, la maladie reste présente. La fièvre Q est une maladie à déclaration obligatoire depuis 1977 (83).

Entre 1962 et 1981, 111 cas ont été rapportés. A l’exception d’un seul, tous étaient de sexe masculin. De plus, la seule femme malade aurait pu être contaminée à l’étranger, puisque les signes cliniques se sont déclarés six jours après son retour d’un séjour en Grèce de trois mois. La majorité des hommes infectés (102/110) avait récemment travaillé dans un abattoir. La majorité des patients infectés avait présenté un tableau clinique fébrile isolé (81/111 : 72,9%). Les autres tableaux cliniques retrouvés étaient une fièvre prolongée dans 18 cas (16,2%), une pneumopathie atypique chez huit patients (7,2%) et une hépatite aiguë dans trois cas seulement (2,7%). Un seul cas d’endocardite avait été diagnostiqué (83).

Entre 1977 et 1994, le nombre annuel de cas déclarés variait entre 202 et 860, malgré le développement d’un vaccin efficace, disponible depuis 1989. La plupart des cas provenaient du Queensland et de Nouvelle Galles du Sud. Aucun cas n’émanait du Nord de la Tasmanie. La description des cas montrait une prédominance masculine, dans la tranche d’âge 20-50 ans, sans variation saisonnière, et avec une prédominance géographique en Australie orientale, principalement dans le Sud du Queensland et le Nord de la Nouvelle Galles du Sud (83).

L’incidence de la fièvre Q en Australie est donc encore significativement associée à l’élevage (la séroprévalence chez les vétérinaires est de 9,5% (1)) et à l’industrie de la viande. C’est pourquoi, la vaccination des ouvriers travaillant dans les abattoirs est obligatoire (61). L’incidence de la fièvre Q chronique n’est pas connue en Australie, et seulement cinq décès attribuables à la maladie ont été rapportés entre 1982 et 1994. Comme dans de nombreux autres pays, la fièvre Q est probablement sous-déclarée (83). En Nouvelle Zélande :

Une étude séroépidémiologique a été conduite en 1993 sur 2 181 têtes de bétail et 12 556 chiens de berger, les ovins et les bovins représentant la majorité des ruminants dans ce pays. Aucun sérum n’a été dépisté positif (83).

En 1997, l’introduction de Coxiella burnetii a été suspectée lors de l’importation illégale de lapins infectés par le virus de la Maladie Hémorragique du Lapin depuis une zone d’enzootie d’Australie. Les lapins auraient été coinfectés par les deux agents. Mais l’étude qui a suivi a montré qu’il n’en était rien et que les trois résultats positifs étaient des faux-positifs (54). Les auteurs concluent que la Nouvelle Zélande est indemne de fièvre Q animale et humaine (54, 83).

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En Asie Au Japon :

Des enquêtes séroépidémiologiques ont démontré que la fièvre Q est enzootique chez l’animal. Le premier isolat à partir de sang humain date de 1989 (83).

Deux études ont été conduites sur des enfants : la première, entre 1982 et 1983, a montré que 39,6% des enfants atteints de pneumopathie atypique étaient porteurs de Coxiella burnetii ; la seconde, conduite entre 1992 et 1993, a décelé la bactérie chez 32,7% des enfants présentant des syndromes pseudo-grippaux (83).

Entre 1978 et 1991, la séroprévalence globale s’élevait à 16,5%, mais était de 22,5% chez les vétérinaires, 11,2% chez les ouvriers de boucheries industrielles, 15,2% chez les insuffisants respiratoires, et seulement 1,6% chez les sujets contrôles, non malades (83). Entre 1997 et 2000, la séroprévalence chez les vétérinaires canins a été mesurée à 13, 5% contre 3,6% chez les donneurs de sang (1). Par conséquent, la fièvre Q semble commune au Japon, comme dans la plupart des autres pays, chez des sujets en contact avec des animaux ou des produits d’origine animale. A Taiwan :

La fièvre Q est considérée comme une maladie émergente. En effet, une étude sérologique effectuée entre 1992 et 2002, dans le Sud, montre que sur 51 patients sérologiquement atteints de rickettsiose, 28 ont des anticorps anti-Coxiella burnetii. 96% des patients sont des hommes et 54% rapportent un contact avec des animaux. Les cas cliniques de fièvre Q aiguë se présentent sous la forme d’une hépatite. La rémission spontanée est fréquente et seuls quelques cas de pneumonies sont rapportés en ce qui concerne les complications (68). En Russie :

Les statistiques officielles russes de 1957 à 1995 rapportent 11058 cas de fièvre Q provenant de 37 territoires administratifs, dont 39% de Povolzhje, 31% de Sibérie occidentale et 14% de Chernozemje centrale, principalement des régions d’Astrakhan, de Novosibirsk et de Voronezh. Cependant, la fièvre Q est sous estimée en Russie, du fait des difficultés diagnostiques et du sous-équipement des laboratoires.

Les ruminants sont le réservoir principal, l’augmentation, ces dernières années, du nombre de cas contractés au contact de chèvres étant liée à l’augmentation des effectifs animaux (83, 127). Cependant, il semblerait que l’épidémiologie évolue et que des réservoirs secondaires prennent de l’importance dans la mesure où maladie s’étend à des zones où les patients n’ont de contact ni avec les ruminants domestiques ni avec leurs produits (90). Au Moyen Orient

Coxiella burnetii sévit de façon endémique mais la population locale semble être immunisée. C’est en partie pourquoi les seuls cas rapportés concernent trois militaires ayant contracté la fièvre Q lors de la première guerre du Golfe. L’origine de la contamination serait le contact avec des moutons et des chameaux infectés (42). En Israël, la fièvre Q est endémique. Entre 1981 et 1990, 758 cas de fièvre Q ont été rapportés au Ministère de la Santé. Une série plus récente de 34 cas d’endocardite a permis d’estimer l’incidence annuelle de l’endocardite à 3,5 cas par an, soit 0,75 cas par million d’habitants par an. Une exposition possible aux ruminants était retrouvée chez 29% des patients, dont huit vivaient en milieu rural (83, 127).

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En Europe En Slovaquie :

Seuls quelques centaines de cas de formes aiguës et aucun cas de forme chronique ont été rapportés depuis les 20 dernières années (90). En Bulgarie :

Les chèvres ont été identifiées ces dernières années comme étant le réservoir principal de Coxiella burnetii. Des centaines de cas de formes aiguës liées à un contact étroit avec des chèvres ou à la consommation de leur lait (61) ont été confirmés par des méthodes sérologiques. Des formes chroniques ont aussi été observées (90). En Yougoslavie :

20 cas de fièvre Q aiguë ont été rapportés en 2002 : il s’agissait de militaires qui s’entraînaient à proximité d’un champ où des moutons infectés avaient pâturé et mis bas. 13,4% des soldats ont contracté l’infection qui s’est manifestée pour 11 d’entre eux (55%) par une pneumonie (28). En Grèce :

En 1990, sur 3686 cas de pneumopathie atypique, on retrouvait 4,7% de sérologies Coxiella burnetii positives. Devant une séroprévalence très élevée (38,1%) retrouvée dans deux villages de Crète, un suivi prospectif a été réalisé par le « National Reference Center of Parasitology, Zoonoses and Geographical Medicine » d’Heraklion. Entre 1989 et 1993, 98 cas de fièvre Q ont été diagnostiqués par sérologie (IFI). La majorité des patients (73,5%) étaient des hommes. Les tranches d’âge les plus à risque étaient [20-39 ans] et [80-89 ans]. Une variation saisonnière de l’incidence était retrouvée, avec un pic entre janvier et juin. Un contact avec des animaux ou l’ingestion de produits laitiers non pasteurisés étaient notés chez 34,5% des cas. Le tableau clinique associait fièvre (91,7%) et signes respiratoires (88,5%), tandis qu’une hépatite n’était retrouvée que dans 52% des cas. Des troubles neurologiques étaient notés chez 11% des patients et une éruption cutanée chez 2% (83, 127). En Italie :

La fièvre Q est présente dans ce pays depuis la seconde guerre mondiale sur un mode épidémique et ce, jusqu’au début des années 1960 (17).

Depuis, seuls quelques cas sporadiques ont été décrits, suggérant un état endémique de la maladie, mis à part un épisode épidémique important décrit dans le Nord-Est du pays en 1993, dans la région de Vicenza, après le passage de plusieurs troupeaux transhumants. Alors que trois cas seulement avaient été officiellement rapportés dans cette province entre 1983 et 1992, 58 cas ont été diagnostiqués durant les cinq mois de l’enquête. La plupart des cas étaient des hommes. Le tableau clinique associait fièvre (100%), asthénie (81%), céphalées (76%) et frissons (72%). Une toux était notée chez 47% des patients et 81% des radiographies thoraciques pratiquées montraient des anomalies. Une hospitalisation avait été nécessaire pour 48% des patients. Le seul facteur de risque retrouvé était une exposition aux troupeaux transhumants. Sur les 100 troupeaux testés, 30 étaient infectés par Coxiella burnetii, avec des séroprévalences variant de 12 à 55% (83, 127).

En zone urbaine, la séroprévalence a été mesurée à 6,1% dans les années 1990 (128). En 2000, une étude rapporte que 24,9% des sylviculteurs de Toscane sont porteurs d’anticorps anti-Coxiella burnetii (17). De plus, de nombreux cas ont été déclarés à l’OIE en 2000 et 2001 (995 cas par an), ce qui tendrait à montrer une recrudescence du caractère endémique (6).

33

En Espagne : La répartition géographique des cas montre une prédominance dans les provinces du

Nord, Pays Basque et Navarre, attribuée à une plus grande densité d’élevage. La fièvre Q est la seconde cause (60% des cas (129)) de pneumopathie contractée en collectivité (après Streptococcus pneumoniae) au Pays Basque (83). Dans le Sud, la maladie représente 30% des cas d’hospitalisation pour syndrome fébrile durant plus de sept jours (129).

C’est la région de Gipuzkoa (Pays Basque) qui connaît la plus forte prévalence de fièvre Q : entre 1984 et 1998, 979 cas ont été diagnostiqués dans cette province de 676 208 habitants, ce qui correspond à 9,65 cas pour 105 habitants. 75,4% des cas concernent des jeunes adultes, 75,4% sont des hommes, et 78,9% des cas se sont déclarés dans les six premiers mois de l’année. La maladie se présente le plus fréquemment sous la forme pneumonie. Seuls deux cas d’endocardite ont été diagnostiqués (83).

En juin 1992, une épidémie touchant 48 soldats du Groupe des Opérations Spéciales s’est déclarée dans le province de Burgos (Nord du pays) : 41 ont dû être hospitalisés et 20 présentaient des signes radiologiques d’atteinte pulmonaire. L’étude épidémiologique a montré que la source de l’infection était une étable abandonnée située dans la campagne avoisinante dans laquelle les militaires avaient dormi. Une relation significative a également été établie entre le temps d’exposition à cette source et l’incidence des cas (135).

Un grand nombre de cas proviennent également de la région de Madrid, mais cela peut être biaisé par la proximité du Centre de Référence : la séroprévalence serait de 15,4% au sein de la population rurale et de 8,8% au sein de la population urbaine (83, 128).

La prévalence semble plus faible dans les provinces du Centre et du Sud (83). Par ailleurs, la présentation clinique varie selon les régions : la pneumopathie est plus

fréquente dans le Nord (Pays Basque), alors que c’est l’hépatite qui prédomine dans le Sud (Andalousie) (83).

Dans les Iles Canaries, à Gran Canaria, la séroprévalence est de 23,9%. 59 cas de fièvre Q aiguë ont été recensés entre 1998 et 2000, fixant l’incidence de la maladie à cinq cas pour 100 000 habitants et par an. Il s’agit de cas sporadiques apparus entre les mois d’avril et de juillet pour la majorité (65%) sous la forme de syndrome fébrile et d’hépatite subclinique. 57% des patients nécessitèrent néanmoins une hospitalisation (22). En Allemagne :

C’est le seul pays européen disposant d’un système de déclaration obligatoire spécifique pour la fièvre Q (3).

Les premiers cas ont été décrits dans le Sud du pays, à Tübingen, en 1947. Depuis lors, la maladie est endémique sur tout le territoire (56).

L’incidence est passée de 0,8 cas par an pour un million d’habitants, entre 1979 et 1989 à 1,4 cas par an pour un million entre 1989 et 1999. L’incidence est en général plus importante dans les Etats du Sud, notamment dans le Baden-Württemberg où elle atteint 4,1 cas annuels pour un million de personnes, sur la période 1979-1999. L’interprétation de cette augmentation de l’incidence doit néanmoins tenir compte de l’amélioration des moyens diagnostiques et de l’intérêt croissant des scientifiques pour cette maladie.

La répartition des cas dans le temps semble suivre une certaine cyclicité dont la période est de quatre à six ans et dont les pics correspondent à l’apparition d’une épidémie.

Des études de séroprévalence, menées entre 1983 et 1986, ont montré que la fièvre Q concernait 22% des donneurs de sang répartis dans les 16 Etats et 22% des personnels au sein des forces armées.

En outre, 40 épidémies ont été décrites dans le pays entre 1947 et 1999 : les moutons, via leur laine, contaminée par des déjections de tiques ou via les produits de parturition, ont été incriminés comme source dans 24 épidémies. Les bovins seraient la cause présumée de six

34

autres épidémies : les malades se seraient contaminés par ingestion de lait contaminé, par exposition aux produits de parturition ou par exposition aux carcasses à l’abattoir. Le vent et le temps sec ont été des facteurs de dissémination dans 14 épidémies. Enfin, deux des 40 épidémies étaient liées à l’infection de personnes au sein d’un laboratoire.

La période d’apparition de ces épidémies a évolué sur les 20 années étudiées. En effet, on observe une diminution du nombre d’épidémies hivernales et une augmentation du nombre d’épidémies apparaissant au printemps et en été, en relation avec la saison d’agnelage de plus en plus tardive. De plus, le phénomène se déplace également dans l’espace : alors que la fièvre Q était une maladie quasi-exclusive des zones rurales dans les années 1950, on constate qu’à l’heure actuelle, les épidémies touchent de plus en plus les zones urbaines et péri-urbaines. Ceci s’explique sans doute par l’urbanisation croissante de ces zones (56).

Une des plus récente épidémie a été signalée en mai 1996 à Lohra-Rollshausen dans l’Etat de Hessen. 49 cas dont 35 avec des manifestations cliniques ont été identifiés parmi les 300 habitants. Quatre patients ont dû être hospitalisés pour pneumonie. L’origine de cette épidémie a été précisée : il s’agissait d’une grande ferme d’ovins (1 000 têtes) située au Nord-Ouest de l’agglomération. L’agnelage avait été intense durant les mois de décembre et janvier précédant l’épidémie et il s’était déroulé à la fois dans la bergerie et à l’extérieur. De plus, les études sérologiques ont montré que 75% des brebis avaient des anticorps anti-Coxiella burnetii. Par ailleurs, le mois de janvier avait été particulièrement sec et un vent de Nord-Ouest soufflait en moyenne 17 jours par mois (75). En Suisse :

La séroprévalence est de 10,9% en zone urbaine (128) et 17% en zone rurale (56). 30 à 90 cas de fièvre Q sont déclarés chaque année à l’Office Fédéral de Santé Publique (83, 127).

En 1983, une importante épidémie de fièvre Q s’est déclarée en Valais, à Val de Bagnes (4 652 habitants). L’épidémie a débuté trois semaines après la redescente d’alpages de troupeaux de 850 à 900 moutons. 415 cas de fièvre Q ont été diagnostiqués, 191 patients (46%) ont été très symptomatiques. Parmi tous les séropositifs, 21,1% habitaient des villages directement sur le trajet des moutons, 2,9% habitaient hors de ce trajet. Les tests effectués sur les moutons en causes ont montré que 38% des 448 moutons testés avaient des anticorps anti-Coxiella burnetii (83, 127). Un travail récent a repris l’évolution de l’état des patients après 12 ans : le risque de développer un accident cérébro-vasculaire ou une ischémie myocardique est plus important parmi les cas de fièvre Q aiguë de l’enquête que parmi les sujets négatifs (127). Au Royaume-Uni :

Entre 1967 et 1974, 48 à 78 cas par an ont été rapportés par les Laboratoires de Santé Publique avec une moyenne de 59 cas par an (128).

De 1975 et 1995, entre 67 et 169 cas de fièvre Q ont été rapportés annuellement au Centre de Surveillance des Maladies Transmissibles (Communicable Diseases Surveillance Center) par des laboratoires d’Angleterre et du Pays de Galle. Ces chiffres représentent une incidence stable entre 0,15 et 0,35 cas pour 100 000 habitants par an. Les 461 cas rapportés entre 1991 et 1995 en Angleterre, Pays de Galle, Irlande du Nord et Iles Anglo-Normandes, étaient principalement composés d’hommes (485 contre 151 femmes, soit un sex-ratio de 3,2), d’âge moyen de 46,2 ans, avec une incidence plus importante en mai. La plupart des cas provenaient d’Irlande du Nord et du Sud-Ouest de l’Angleterre. Dans une série de 90 cas, l’endocardite représentait 11% des cas diagnostiqués de fièvre Q. La fièvre Q représente environ 3% de l’ensemble des endocardites en Angleterre et au Pays de Galle (83, 127).

Entre 1980 et 1996, huit épidémies ont été rapportées : 29 cas communautaires en 1982 au Pays de Galle ; 14 cas dans le Sud-Ouest de l’Angleterre la même année, au sein d’une

35

équipe de chercheurs qui travaillaient sur des moutons infectés expérimentalement ; 25 cas chez des postiers à Oxford en 1983 ; deux infections acquises dans un laboratoire en Irlande du Nord en 1986 ; cinq cas scolaires dans la Sud-Ouest de l’Angleterre en 1987, probablement contaminés par les animaux de l’école (volailles et caprins) ; 147 cas dans les Midlands et 47 cas communautaires en Irlande du Nord, en 1989; enfin, quatre cas en 1992 sur l’Ile de Wight, chez des employés de déchetterie (83, 127).

Afin d’évaluer les risques professionnels chez les fermiers, une étude de séroprévalence et d’incidence a été menée sur 404 fermiers et 395 policiers et personnels de service d’urgence. La prévalence était trois fois plus importante chez les sujets travaillant dans une ferme (27,3%) que chez les sujets non exposés (10,9%). Aucune séroconversion n’a été observée dans la première année, puis deux la deuxième année, ce qui représente une incidence annuelle de 813 pour 100 000 personnes. La présence d’anticorps anti-Coxiella burnetii était significativement associée à l’exposition à du bétail, et en particulier aux animaux gestants et aux produits de conception.

Plus récemment, la séroprévalence de la fièvre Q a été étudiée dans l’Ouest du Pays de Galle. Sur un échantillon de 265 personnes, tirées au sort dans la population active, la prévalence globale était de 7,9%, tandis qu’elle était de 15,1% en milieu rural et de 4,2% chez les sujets travaillant dans d’autres secteurs. La consommation de produits laitiers non pasteurisés et la manipulation de systèmes de traite automatisée étaient également des facteurs de risque (83, 127).

En 2001, seulement 74 cas ont été signalés (6). Cette baisse d’incidence est probablement due à l’épizootie de fièvre aphteuse (86).

En 2002, une épidémie a frappé les ouvriers d’une manufacture de carton à Newport au Pays de Galles : 59 cas confirmés, 13 cas probables et 14 cas suspects. Certains patients ont dû être hospitalisés et d’autres souffrent encore d’asthénie persistante. La source de l’infection n’a pas été identifiée mais l’hypothèse la plus plausible serait la contamination de l’environnement par un animal infecté (chat, par exemple) (86).

Tableau V : nombre de cas humains déclarés à l’OIE* entre 1996 et 2001 (6).

Nombre de cas humains Pays En 2001 En 2000 En 1999 En 1998 En 1997 En 1996

Allemagne 298 206 276 147 78 72 Bulgarie 57 147 215 191 Croatie 51 26 20 26 51 98 Espagne 102 177 177 190 Hongrie 1 3 1 3

Italie 995 995 152 697 Pays-Bas 14 10 6 9 16 15 Portugal 12 9 721 872

Royaume-Uni 74 107 111 112 122 147 Suisse 11 16 13

Ukraine 3 13 3 7 Yougoslavie 21 24 3 62 28

* OIE : Office International des Epizooties.

36

2.3.1.2.2. En France

chez les animaux : Seules quelques études, menées dans les années 70-80, ont été réalisées afin de mieux

connaître l’incidence de la fièvre Q chez les ruminants : il en ressort que la maladie semble couvrir tout le territoire national (116).

En 1975, une enquête épidémiologique, dans le Sud-Est de la France, a révélé que 16 à 21% des ovins testés étaient séropositifs. Dans le Sud-Ouest, une autre enquête a montré que 0,6% des ovins étaient positifs. En 1986, une séroprévalence de 14% a été obtenue pour quatre troupeaux d’ovins dans le Sud-Est de la France (116).

Chez les petits ruminants, un bilan des avortements infectieux déclarés entre 1976 et 1981 dans le Sud-Est du pays, indiquait 1,9% (9/484) d’avortements imputables à Coxiella burnetii chez les ovins et 5,5% (6/110) chez les caprins (117).

Sur le plan clinique, un taux important d’avortements (entre 10 et 25%) et de mises bas prématurées ont été rapportés sur cinq troupeaux caprins, en 1979, dans la Vienne (116, 117).

Dans la région Poitou-Charentes, la fièvre Q a été signalée à plusieurs reprises comme la première cause infectieuse abortive chez les caprins, avant la chlamydiose et la toxoplasmose (117).

Plus récemment, entre 1999 et 2000, un sondage conduit dans le Sud-Est à l’aide de la technique d’immunofluorescence indirecte phase II a montré que 33% des brebis (sur un total de 318) étaient positives en fièvre Q, 100% des troupeaux (sur un total de 16) démontraient une exposition à Coxiella burnetii avec des pourcentages d’animaux séropositifs variant de 5 à 75% (115).

Tableau VI : enquêtes menées en France sur la séroprévalence de Coxiella burnetii chez les ruminants (117).

Espèces animales

Lieux

(période)

Pourcentage d’animaux séropositifs

Echantillon

Technique

sérologique*

Ovins

Sud-Est (1973-1974) Puy de Dôme (1977) Sud-Ouest (1978-1979) Sud-Est(1985)

17,3 0,3 0,6

14/39

2 530 4 222 4 850 242

FC FC FC

FC/IFI

Caprins Puy de Dôme (1977) Sarthe (1975-1980) Sud-Ouest (1978-1979)

0 5,72

1

132 787 400

FC FC FC

Bovins

Puy de Dôme (1977) Sarthe (1975-1980) Haute-Savoie (1980-1981)

1,8 1,41 12,3

2 222 6 475 4 477

FC FC FC

*Techniques sérologiques : FC : fixation du complément, IFI : immunofluorescence indirecte.

Par ailleurs, quelques sondages partiels ont signalé la présence de porteurs de Coxiella

burnetii autres que les ruminants. Concernant les chiens, une étude dans le Sud-Est a montré que 9,8% des chiens de l’armée possédaient des anticorps (en IFI) : les chiens en contact avec les moutons sont plus

37

fréquemment séropositifs que ceux sans contact (soit 26,3% en zone rurale et 5,9% en zone urbaine) (23). Concernant les oiseaux, l’infection a été démontrée chez le corbeau, dans les Alpes, en 1968 (117). Plus récemment, en 1999, Coxiella burnetii a été détectée dans les fientes de pigeons et chez leurs tiques, dans le Lubéron (126). Finalement, en France, la présence de la fièvre Q animale sur le territoire est révélée par la prévalence des infections humaines et de leur incidence clinique (117).

chez l’Homme : L’épidémiologie de la fièvre Q humaine est beaucoup mieux cernée que celle de la

maladie animale. Elle est présente sur l’ensemble du territoire : 4 à 5%, en moyenne, des donneurs de sang sont séropositifs. La prévalence est plus marquée dans le Sud du pays, dans les zones d’élevages ovins et caprins. La séroprévalence la plus élevée a été retrouvée dans les Alpes où 30% des habitants d’un village étaient séropositifs (116).

En 1988, la séroprévalence était de 4,03% à Marseille et de 5% en Côte d’Or (128). L’incidence annuelle la forme aiguë est estimée à 50 pour 100 000 personnes. L’incidence de l’hospitalisation pour fièvre Q aiguë est de 1,7 pour un million et celle pour forme chronique est de 0,5 pour un million (77).

En 1996, dans le Centre de la France, la séroprévalence était de plus de 70% chez les personnes impliquées dans l’élevage de caprins (117).

En mars de la même année, une étude descriptive d’une épidémie urbaine survenue parmi les habitants de Briançon, un village des Hautes Alpes, a permis d’incriminer un abattoir (à proximité d’un héliport), où des agneaux avaient été abattus en grande quantité : 29 cas ont été identifiés parmi les 12 000 habitants, 12 cas ont justifié une hospitalisation (18, 26).

En 2000, dix cas ont été recensés dans la Drôme. L’enquête cas-témoins a permis d’incriminer un élevage de caprins, massivement contaminé, et une zone d’épandage (14). Par ailleurs, les zones de Martigues et de l’étang de Berre, non loin de Marseille, sont des foyers hyperendémiques depuis au moins dix ans (117, 129). Ceci s’explique par une forte densité d’élevages de moutons (70 000 têtes) associée au Mistral qui souffle depuis les zones d’élevages vers les zones d’hyperendémie (129).

En 1992, une étude, réalisée sur 323 cas de formes aiguës, a montré que la présentation clinique la plus courante dans notre pays était l’hépatite (61,9%) plus que la pneumonie (45,8%) (61).

En 1993, les endocardites à Coxiella burnetii représentaient 1 à 2% de toutes les endocardites (128).

Actuellement, la détection de l’ensemble des malades atteints de fièvre Q n’est pas efficace : une étude rétrospective sur 14 années (1985-1998) réalisée au Centre National de Référence pour l’Etude des Rickettsioses (CNR), a permis d’évaluer l’incidence à 600 personnes par an pour la forme aiguë (au lieu de 100 patients diagnostiqués et suivis) et de 60 par an pour la forme chronique (au lieu de 32) (115, 117). Cette sous-estimation de l’incidence réelle de la maladie est due essentiellement au polymorphisme clinique qui rend le diagnostic difficile (117).

Le CNR a également rapporté récemment une analyse sur l’ensemble des cas diagnostiqués entre 1985 et 1998 indiquant que sur 100 malades, 40 résident en milieu rural, 23 ont consommé du fromage de chèvre non pasteurisé et 35 ont eu des contacts avec des animaux nouveau-nés ou gestants (117).

38

Les données sur la répartition géographique et sur la prévalence de la fièvre Q sont assez rares en ce qui concerne la maladie animale du fait de la faible incidence économique et de la complexité du cycle épidémiologique. Ces éléments sont mieux cernés en ce qui concerne la maladie humaine même si la fièvre Q reste sous-diagnostiquée. Néanmoins, la maladie est présente sur tous les continents, les ruminants et les carnivores domestiques étant les principales sources des foyers humains. La Nouvelle Zélande est le seul pays indemne. Il semble, par ailleurs, que la forme prédominante de la maladie (pneumopathie ou hépatite) soit dépendante de la zone géographique. En France, la maladie animale couvre tout le territoire avec une séroprévalence plus importante dans le Sud du pays où l’on retrouve également les foyers humains les plus importants.

2.3.1.2.3. Etude de l’épidémie de Chamonix (juin 2002)

définition des cas : cas de fièvre Q probable : personne résidant ou séjournant dans la vallée de

Chamonix ou dans les communes situées en aval de la vallée (St Gervais-le-Fayet, Domancy, Passy et Sallanches) dans les mois précédant la date de début des signes et ayant présenté une fièvre supérieure à 39°C, accompagnée d’au moins deux signes parmi les suivants : céphalées, myalgies, nausées, frissons et présentant, en plus, une élévation des transaminases.

cas de fièvre Q certain : personne résidant ou séjournant dans la vallée de Chamonix ou dans les communes situées en aval de la vallée (St Gervais-le-Fayet, Domancy, Passy et Sallanches) avec une sérologie positive de fièvre Q (Ig M phase II supérieures à 1 : 25). Un cas certain peut être :

un cas de fièvre Q certain clinique : cas certain ayant présenté des signes cliniques identiques à ceux définis pour un cas probable.

un cas de fièvre Q certain sérologique : cas certain n’ayant pas présenté de signe clinique ou avec signes cliniques inconnus.

description de l’épidémie : Le premier cas certain clinique est survenu le 22 juin 2002 et le dernier date du 20 septembre 2002. Le dernier cas probable est survenu le 10 octobre 2002. Au 12 novembre 2002, le nombre de cas identifiés était pour la vallée de Chamonix :

88 cas certains dont 71 cas certains cliniques et 17 cas certains sérologiques (dont six femmes enceintes, trois porteurs d’une valvulopathie et dix personnes hospitalisées).

37 cas probables. Il faut ajouter à ces cas, quatre cas certains et un cas probable résidant en aval dans la vallée (14).

Sur la courbe épidémique, deux périodes peuvent être distinguées : une première période, du 22 juin au 4 août, pendant laquelle sont survenus 71% des

cas certains cliniques. Une montée brutale du nombre de cas est observée pendant la semaine 27 puis, après une diminution marquée au cours de la semaine 28, un deuxième pic épidémique, plus durable, est observé pendant les semaines 29, 30 et 31. L’ensemble des cas certains cliniques et probables ont une évolution similaire (14). Pour cette période, les taux d’incidence les plus élevés sont observés parmi les

39

résidents du quartier Les Praz-Les Tines (10,1‰), d’un quartier contigu, Le Bois du Bouchet (9,7‰) et du quartier Les Gaillands-Les Moussoux-La Mollard (9,3‰) (13).

une deuxième période, du 5 août au 30 septembre, sans pic apparent, où le nombre de cas est beaucoup moins élevé (14). Pour cette période, le secteur de Chamonix Sud se détache nettement (13).

Figure 8 : courbe de l’épidémie de Chamonix selon la date du début des signes cliniques : 71 cas certains cliniques et 35 cas probables (12 novembre 2002) (13). L’évolution de la courbe est en faveur d’une extinction de l’épidémie. Les informations temporo-spatiales obtenues pour la quasi-totalité des cas permettent d’évoquer l’existence d’une ou plusieurs sources d’exposition, durables et peut-être mobiles. Une enquête épidémiologique à la recherche de l’origine de cette épidémie a été mise en œuvre par l’Institut de Veille Sanitaire (InVS) et la Cellule Interrégionale d’Epidémiologie (CIRE) (14). L’enquête cas-témoins a été menée sur 27 cas certains cliniques survenus de juin à début août et 102 témoins : les résultats préliminaires de cette enquête montrent l’absence d’association entre la maladie et la consommation de fromage, une exposition professionnelle, une participation à des rassemblements de population et le contact direct avec un animal domestique (domicile ou lieu de visite), d’élevage (visite d’élevage) et sauvage (manipulation de cadavres), mais ne permettent pas d’identifier une source unique sur l’ensemble de la période :

pour la période du premier pic, le fait d’avoir eu un contact rapproché avec des moutons ou d’avoir assisté de manière proche à une transhumance de moutons est statistiquement et significativement associé avec une augmentation du risque de survenue de la maladie. Aucune association du même type n’est retrouvée avec les chèvres et les bovins. En revanche, le fait d’habiter à moins d’un kilomètre d’un lieu d’élevage est statistiquement et significativement associé avec une augmentation du risque de survenue de la maladie (13).

pour la période du deuxième pic, aucune association n’est retrouvée (13).

0123456789

10111213141516

24 (10-16/06)25 (17/23/06)26 (24/30/06)27 (01-07/07)28 (08-14/07)29 (15-21/07)30 (22-28/07)31 (29/07-04/08)32 (5-11/08)33 (12-18/08)34 (19-25/08)35 (26/08-01/09)36 (02-08/09)37 (09-15/09)38 (16-22/09)39 (23-29/09)40 (30/09-06/10)41 (07-13/10)

semaines

nombre de cas

cas probables

cas certains cliniques

cas certains cliniques inclusdans l'étude cas-témoins

40

conclusion : L’enquête descriptive a montré la survenue d’une épidémie de fièvre Q dans la vallée de Chamonix. Cette épidémie a duré plus de trois mois, permettant d’affirmer la persistance de l’exposition. L’enquête a permis de distinguer deux périodes en faveur d’une évolution dans le temps d’une ou plusieurs sources d’exposition, avec une source plus importante durant le mois de juin jusqu’au début du mois de juillet. Une enquête cas-témoins a été menée sur une partie des cas de la première période de l’épidémie. Les résultats obtenus montrent qu’un ou plusieurs troupeaux d’ovins sont impliqués dans l’origine de l’épidémie, ceux-ci ayant pu contaminer d’autres troupeaux pendant l’été, l’hypothèse de contamination retenue étant celle d’une transmission aéroportée. Afin d’identifier précisément l’origine de l’épidémie et de prendre des mesures de contrôle et de prévention adaptées, une enquête vétérinaire a été débutée en novembre 2002 sur les troupeaux de moutons, et sur les troupeaux de chèvres et de vaches des éleveurs qui possèdent des moutons (13).

recommandations : Dans l’attente des résultats d’investigations, il a été recommandé aux personnes

appartenant aux catégories à haut risque (femmes enceintes, personnes présentant une atteinte valvulaire cardiaque ou une pathologie grave avec diminution des défenses immunitaires) qui résident dans la vallée de Chamonix ou qui y ont résidé depuis le mois de juin de consulter un médecin le plus rapidement possible en vue de réaliser un test sérologique et éventuellement de traiter précocement toute suspicion clinique de fièvre Q (12).

2.3.2. Epidémiologie analytique

2.3.2.1. Facteurs de réceptivité intrinsèques prédisposants

2.3.2.1.1. Espèce

ce sont les vertébrés à sang chaud, mammifères et oiseaux, qui sont les plus touchés par l’infection à Coxiella burnetii.

chez les mammifères domestiques :

les ruminants sont les hôtes principaux (34, 75, 115, 117, 126, 127) : Chez les caprins, les femelles à la reproduction et les jeunes nés de mères infectées sont

les principales cibles de la bactérie mais chez les mères, la mortalité est quasi-nulle et le taux d’avortements variable alors que chez leurs produits, la mortalité peut être supérieure à 50% et la morbidité de 100%.

Chez les ovins, les mêmes catégories d’animaux sont touchées mais avec une réceptivité supérieure à celle des caprins.

Chez les bovins, l’affection est moins contagieuse que chez les petits ruminants (36) et la maladie est peu extériorisée (faible poids de naissance des veaux, infertilité (127)). Cependant, les bovins et notamment les vaches laitières présentent plus souvent une infection chronique que les ovins. De plus, la prévalence est non négligeable : dès 1951, une étude menée en Californie a montré que 40% des bovins importés d’une zone d’enzootie présentaient une séroconversion vis-à-vis de Coxiella burnetii (127).

Les Camélidés, les chevaux et les buffles peuvent aussi contracter l’infection (34, 38, 127).

41

les carnivores domestiques, les chiens et surtout les chats, sont couramment infectés mais demeurent asymptomatiques (23, 40, 80).

les porcins : Coxiella burnetii a été isolée de façon sporadique à partir de ces espèces (127).

chez les mammifères sauvages, l’infection est asymptomatique mais entraîne une

séroconversion (34). Ainsi, Coxiella burnetii (ou les anticorps dont elle a provoqué l’apparition) a été retrouvée chez de nombreuses espèces (34, 38, 127) :

les marsupiaux comme le bandicoot. les lagomorphes : lapins et lièvres. les rongeurs : rats (la séroprévalence serait de 7 à 53% selon une étude anglaise (83)), souris, mulots, campagnols, musaraignes, ...

les carnivores sauvages : ours, renards, léopards, hyènes, … les ruminants sauvages : mouflons, daims, cerfs, antilopes, … les hérissons, porcs-épics. les chiroptères. les babouins.

chez les oiseaux, également, de nombreuses espèces sont concernées et l’infection ne

provoque aucun symptôme : les volailles domestiques : poules, dindes, oies, canards (38, 127). les corbeaux et les corneilles (117). les pigeons, les hirondelles, les moineaux, les cailles (34, 38, 126, 127). les oiseaux migrateurs (36, 116).

chez l’Homme, la contamination est accidentelle mais revêt une grande importance

médicale du fait de la gravité potentielle de la maladie. Les populations à risque sont celles en contact avec les animaux ou leurs produits. Il s’agit donc de populations plutôt rurales : éleveurs, vétérinaires, marchands de bestiaux, personnels des laiteries, des abattoirs, ouvriers de tanneries, de l’industrie lainière, de laboratoires cultivant Coxiella burnetii (36, 38, 128). Toutefois, ces personnes, qui ont sans doute acquis une immunité, présentent des symptômes moins marqués lorsqu’elles manifestent la maladie. C’est en zone semi-urbaine, où les personnes n’ont pas acquis d’immunité, que les symptômes de la fièvre Q sont les plus marqués lorsqu’une épidémie survient (115).

chez les vertébrés à sang froid, quelques études ont montré que l’infection existait : des anticorps ont été détectés chez des serpents et des tortues en Inde, mais Coxiella burnetii n’a pas été isolée à partir de ces animaux (83). Quelques auteurs évoquent également l'infection des poissons, des amphibiens et des reptiles mais sans donner beaucoup de précisions (38).

les arthropodes et notamment les arthropodes hématophages sont largement contaminés par Coxiella burnetii. Plus de 40 espèces de tiques dures ou molles sont ainsi naturellement infectées par Coxiella burnetii, dont Rhipicephalus sanguineus, la tique du chien, Argas sp. et Dermanyssus sp., parasitant les oiseaux, Haemaphysalis humerosa, retrouvée sur les bandicoots, Amblyomma triguttatum, tique du kangourou, et plusieurs espèces capturées aux Etats-Unis : Dermacentor occidentalis, Amblyomma americanum, Haemaphysalis leporis-palustris, Ixodes dentatus et Otobius magnini (83, 127, 38). A Chypre, également,

42

les souches Nine Mile et Q212 ont été retrouvées chez 10% des tiques collectées (Rhipicephalus sanguineus et Hyaloma sp.) (120). Coxiella burnetii a été également isolée de manière anecdotique chez d’autres arthropodes, tels que les aoûtats, les poux, les mites, les mouches (36, 83, 127), les blattes, les vers de farine et les punaises (34).

2.3.2.1.2. Sexe

chez les vertébrés, c’est la femelle qui extériorise la maladie essentiellement pendant la période de gestation (34).

chez les tiques, ce sont aussi les femelles qui transmettent l’infection car elles sont hématophages (34).

la maladie humaine concerne plus volontiers les hommes. Ceci serait en relation avec des facteurs d’exposition notamment professionnels différents entre les populations féminines et masculines (61, 128). En fait, les taux de séroprévalence, en France, ne sont pas plus élevés chez les hommes, c’est le ratio symptomatique/asymptomatique qui est en faveur des femmes (77), peut-être est-ce en relation avec un effet protecteur des hormones femelles et notamment du 17β-œstradiol comme cela a été récemment montré chez la souris (70).

2.3.2.1.3. Age

les animaux primipares expriment plus fréquemment la maladie que les multipares (112). les jeunes animaux (veaux, chevreaux, agneaux) nés de mères infectées sont très réceptifs

à la maladie, celle-ci entraînant souvent la mort (4, 30). chez l’Homme, l’incidence est plus élevée entre 30 et 39 ans pour la forme aiguë, alors

que la tranche 60-69 ans est la plus atteinte par la forme chronique (128). Les enfants sont fréquemment exposés (77) et infectés (128) par Coxiella burnetii alors

que, paradoxalement, le nombre de cas cliniques rapportés chez l’enfant est faible (77) sauf au Japon où la détection sérologique de Coxiella burnetii chez des enfants atteints de pneumonie atypique est très élevée (61). Deux explications sont possibles : soit les enfants sont moins souvent symptomatiques que les adultes (128), soit la maladie est sous-diagnostiquée dans cette catégorie de la population (77).

2.3.2.1.4. Etat physiologique

Chez l’animal comme chez l’Homme, l’état d’immunodépression, physiologique ou non, est un facteur de réceptivité crucial (34, 83, 105, 127) :

- facteurs physiologiques : chez l’animal :

la gestation entraîne une réceptivité maximum à la contamination, particulièrement pendant les 100 premiers jours chez la brebis et la chèvre (112) ; c’est lors de la mise bas que l’excrétion de Coxiella burnetii est maximale (80, 116).

une alimentation carencée. une alimentation exclusivement à base d’ensilage a un effet immunodépresseur car il diminue les apports en oligo-éléments notamment en magnésium et en fer (36).

43

chez l’Homme : la grossesse est un facteur de réceptivité comme chez les animaux. Ainsi, une infection à Coxiella burnetii contractée au cours du premier trimestre augmente les risques d’avortement. Une infection au cours du second semestre augmente les risques d’accouchement prématuré. De plus, la grossesse favorise l’apparition d’une forme chronique de fièvre Q (105, 106).

- facteurs non physiologiques :

chez l’animal : certains médicaments sont immunodépresseurs comme la méthylprédnisolone, les cyclophosphamides, … (34).

les maladies intercurrentes et particulièrement la salmonellose et la listériose favorisent la contamination par Coxiella burnetii (34).

chez l’Homme : les maladies de type cancer, sida, maladie de Crohn, maladie d’Hodgkin, leucémie (61, 105).

la corticothérapie, les hémodialyses, la splénectomie sont autant d’actes qui peuvent favoriser une forme chronique de fièvre Q (61, 105).

une valvulopathie ou une prothèse valvulaire sont des facteurs à prendre en compte lors d’une infection à Coxiella burnetii (24, 105).

La réceptivité à l’infection dépend de facteurs intrinsèques : - l’espèce : les ruminants domestiques, caprins, ovins et bovins, sont les principales

espèces infectées par Coxiella burnetii. Cependant, la bactérie a été isolée chez de nombreux autres animaux : carnivores domestiques, mammifères sauvages, oiseaux, reptiles, arthropodes dont 40 espèces de tiques. L’Homme est une cible accidentelle ; ce sont surtout les populations en zone semi-urbaine qui, n’ayant pas acquis d’immunité, manifestent les symptômes les plus marqués.

- le sexe : chez les animaux, ce sont préférentiellement les femelles qui extériorisent la maladie. Chez l’Homme, la séroprévalence ne dépend pas du sexe mais le ratio symptomatique/asymptomatique est en défaveur des hommes.

- l’âge : la mortalité est élevée chez les jeunes animaux, de même que la morbidité chez les primipares. Chez l’Homme, l’incidence est importante entre 30 et 39 ans, pour la forme aiguë, et dans la tranche 60-69 ans, pour la forme chronique. Le nombre de cas cliniques chez l’enfant est faible.

- l’état physiologique : tous les facteurs d’immunodépression, physiologiques ou non, augmentent la réceptivité vis-à-vis de Coxiella burnetii.

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2.3.2.2. Facteurs de réceptivité extrinsèques adjuvants

2.3.2.2.1. Mode d’élevage

En élevage extensif, la réceptivité est augmentée par un contact plus étroit avec les réservoirs sauvages et par l’absence de contrôle des mises bas (34).

En élevage intensif, la surpopulation, la promiscuité et le confinement favorisent les contaminations (115, 117). De même, l’élevage des animaux en stabulation libre par rapport à l’élevage à l’attache, et la haute production (Vaches Laitières Hautes Productrices) prédisposent à l’infection (36).

La transhumance majore la propagation de l’agent de la fièvre Q par les nombreux contacts qu’elle impose entre animaux de troupeaux différents ou avec d’autres espèces animales (115, 116, 117).

Le renouvellement des troupeaux peut aussi provoquer l’apparition de l’infection dans un élevage par l’introduction d’un animal infecté : des études menées en Californie, en 1951, ont montré que lorsque des vaches étaient importées dans des régions d’enzooties, 40% d’entre elles s’infectaient en six mois (115).

2.3.2.2.2. Climat

La température, dans la mesure où elle influence la survie des tiques, joue un rôle dans la répartition de la fièvre Q : 10°C est la température critique minimale de développement des tiques et 20°C, la température optimale (34).

Par ailleurs, le vent, le temps sec, une végétation aride sont des facteurs qui favorisent la dissémination des aérosols, véhicules de Coxiella burnetii (116, 117).

2.3.2.2.3. Souche de Coxiella burnetii La souche de Coxiella burnetii ne semble influer ni sur la réceptivité ni sur la forme clinique, qui serait plutôt liée aux prédispositions de l’hôte. La souche serait en fait seulement liée à une localisation géographique (38).

La réceptivité des individus à Coxiella burnetii dépend également de facteurs extrinsèques : - le mode d’élevage : l’élevage extensif favorise les contacts avec la faune sauvage mais l’élevage intensif entraîne un confinement favorable à la transmission de l’agent, de même que l’élevage en stabulation libre, la transhumance, la haute production et le renouvellement des troupeaux.

- le climat : le vent, le temps sec et la végétation aride favorisent la dissémination des aérosols infectieux.

- la souche : la souche de Coxiella burnetii n’a aucune influence.

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2.3.2.3. Origine de la contamination

2.3.2.3.1. Sources de contamination

vertébrés : chez les ruminants, ce sont surtout les ovins, les caprins et en troisième position les

bovins qui sont à l’origine de la contamination humaine, mais aussi inter animale (34, 36). Cependant, la virulence de Coxiella burnetii semble être atténuée au cours du passage d’un hôte à l’autre (30). De plus, l’affection est moins contagieuse chez les bovins que chez les petits ruminants (34, 36).

les volailles d’élevage sont aussi une source de contamination pour l’Homme (115, 126).

les vertébrés sauvages, en entretenant la maladie, contribuent à sa diffusion (34). le chien et les oiseaux (corneilles, corbeaux) se contaminent par l’ingestion de

placenta infecté (36, 115). Le chien infecté se comporte ensuite comme un agent de propagation par excrétion de la bactérie dans ses matières fécales ou par contamination des tiques qu’il héberge (116).

le chat se contamine par l’ingestion de souris et autres rongeurs infectés (36, 116). les carnivores et lagomorphes domestiques (chats, chiens et lapins) sont une source de

contamination pour l’Homme lors de la mise bas (115, 126, 129). Cette source de contamination pourrait expliquer en partie les cas de fièvre Q en zone urbaine (117).

le pigeon est un porteur chronique, source de contamination par ses fientes (126). les oiseaux migrateurs, porteurs de la bactérie, disséminent l’infection dans les

élevages de ruminants (36, 116). l’Homme n’est pas réellement une source de contamination dans la mesure où il s’agit

d’un hôte accidentel. La source primaire de contamination est constituée par les animaux malades : ils assurent ainsi la contamination intra et interspécifique ainsi que celle du milieu extérieur. Les autres animaux, domestiques ou sauvages, infectés de façon asymptomatiques par Coxiella burnetii, sont considérés comme des réservoirs.

arthropodes : Ce sont des réservoirs et des vecteurs de l’infection mais leur rôle de vecteur,

contrairement aux autres Rickettsies, est loin d’être indispensable à la propagation de Coxiella burnetii, du moins chez les animaux domestiques (116, 117, 127).

La plupart des vertébrés présentent une bactériémie transitoire (sept jours (34)) rapidement après l’infection par Coxiella burnetii. Dans ces conditions, les tiques peuvent facilement ingérer la bactérie lors de leurs repas sanguins. Coxiella burnetii contamine l’hémolymphe et les hémocytes de la tique à partir du cinquième jour après le repas infectant ; puis, elle se multiplie, à partir du dixième jour, dans les cellules du tube digestif ou dans l’estomac de la tique puis est excrétée dans la salive et les fécès (34, 38, 127).

Comme chez les autres animaux et l’Homme, la bactérie se trouve en phase I, et est donc hautement infectante. Lors de son repas sanguin, la tique élimine des fécès hautement contaminées sur la peau de son hôte, la transmission de l’agent peut donc se faire soit de façon directe (elle est maximale lors de la phase de gorgement rapide) soit de façon indirecte par ingestion de ces déjections (34, 127).

Coxiella burnetii est également retrouvée dans les ovaires de la tique, ce qui permet une transmission transovarienne et transstadiale d’où une pérennité importante de l’infection dans cette population animale (38, 115, 127).

46

2.3.2.3.2. Réservoirs

Coxiella burnetii persiste longtemps dans les organismes animaux ainsi que dans le milieu extérieur (134) qui deviennent alors des réservoirs de la maladie.

les réservoirs principaux, en ce qui concerne la contamination humaine, sont les femelles de ruminants domestiques (117, 126) : ovins, bovins et caprins, d’autant que ces deux dernières espèces ont une prédisposition à l’infection chronique (127). Cependant, les chiens, les chats, les volailles, ainsi que les animaux sauvages ont aussi un rôle de réservoir (36, 38, 83, 127). Les jeunes nés de mères infectées, lorsqu’ils survivent entretiennent l’infection dans le troupeau de façon insidieuse dans la mesure où leur taux d’anticorps est faible (112).

les oiseaux migrateurs porteurs de la bactérie disséminent l’infection dans les élevages (36, 116).

les tiques permettent non seulement l’entretien de la bactérie mais jouent aussi un rôle de relais amplificateur du fait de la transmission verticale de l’agent pathogène. De plus, le passage par ces arthropodes augmente la virulence de Coxiella burnetii (30, 34).

d’autres arthropodes comme les mites, mouches, ou autres poux, porteurs de la bactérie (126) sont aussi en partie responsables de la pérennité de Coxiella burnetii dans la nature (36).

le milieu extérieur, enfin, est un réservoir d’importance épidémiologique notable dans la mesure où il permet le transport des poussières virulentes. Ainsi, les sols, le fumier, le lisier, la paille, le foin, la laine, les vêtements, les différents déchets animaux provenant des abattoirs ou des tanneries ou encore les véhicules de transport en relation avec les activités des élevages sont autant de vecteurs inanimés (34, 115, 117).

2.3.2.3.3. Matières virulentes

matières virulentes internes : Elles ne constituent aucun danger de contamination du vivant de l’animal.

le tissu mammaire et l’utérus : chez la femelle gestante, Coxiella burnetii infecte fortement les glandes mammaires (126) et l’utérus (117).

les nœuds lymphatiques : ils peuvent être infectés pendant au moins 20 mois (95). le sang durant la phase de bactériémie. Celle-ci dure plus ou moins longtemps selon les

espèces ; chez des chats infectés expérimentalement, elle peut durer plus d’un mois (40).

On trouve également la bactérie dans la peau, la rate, le foie, les poumons, les muscles, les intestins et les reins (jusqu’à 78% des carcasses de bovins sont contaminées) (34). De plus, Coxiella burnetii survit jusqu’à 30 jours dans la viande à 4°C (112).

matières virulentes externes : C’est par leur biais que la contamination humaine et animale est possible.

le placenta, les lochies, les enveloppes fœtales, le liquide amniotique : ces tissus sont ceux pour lesquels l’excrétion est maximale (115,117). En effet, le placenta peut contenir plus d’un milliard de bactéries par gramme (117, 126). Ils peuvent être virulents aussi bien lors d’avortement que lors d’une mise bas normale (117). On peut également retrouver la bactérie dans les sécrétions vaginales : une infection expérimentale menée chez la chèvre, à 90 jours de gestation, a provoqué l’avortement

47

et l’excrétion de la bactérie dans les sécrétions vaginales pendant environ 14 jours avec un niveau très élevé les deux premiers jours (115).

la sécrétion lactée : dès 1984, aux USA, Coxiella burnetii est retrouvée dans la moitié des laits de tank. Puis, en Californie, il a été montré que 23% des vaches séropositives sont excrétrices (36). La durée de l’excrétion semble être liée à l’espèce animale. Ainsi, la présence de Coxiella burnetii a été détectée dans le lait de chèvre jusqu’à 91 jours après la mise bas et jusqu’à 32 mois dans le lait de vache (115). Cependant, l’excrétion est irrégulière et intermittente et ne porte que sur un ou plusieurs quartiers. De plus, en France, une étude a montré que les vaches avortées n’excrètent pas systématiquement même celles qui ont une sérologie élevée (36). Le taux d’excrétion dans le lait serait généralement faible sauf dans les premiers jours ou semaines suivant la parturition où Coxiella burnetii peut être présente en grande quantité (105 bactéries/mL chez la vache) (117).

les fécès et les urines des animaux infectés. Le plus souvent il s’agit de ruminants (23, 126).

L’excrétion peut être mise en évidence pendant toute la durée de la lactation (117). Chez la poule, l’infection expérimentale a montré que l’excrétion dans les fécès débute sept jours après l’infection et dure 40 jours (115). Une autre infection expérimentale, sur des chats, a permis de mettre en évidence la présence de Coxiella burnetii dans les urines pendant plus de deux mois (40).

la salive et les fécès des tiques sont des matières hautement virulentes (la concentration en bactéries peut atteindre 1 000 milliards par gramme de fécès (97, 117) et ce, pendant une longue durée : jusqu’à deux ans (96)).

les œufs crus issus de volailles infectées (117, 126). le sperme : Coxiella burnetii a pu être isolée à partir de semence de taureaux

naturellement infectés (116, 117). les poussières contaminées par les excrétions animales : sols lors du nettoyage des

exploitations, fumier ou lisier en période d’épandage, déchets lors d’abattages intensifs, laine lors de la tonte, déchets et cuirs dans les tanneries, routes de transhumance ou encore véhicules de transport en relation avec les activités des élevages (115, 117). En effet, des microorganismes ont pu être retrouvés dans l’air jusqu’à deux semaines après la parturition (117).

Les sources de contamination sont principalement représentées par les ruminants domestiques (ovins, caprins puis bovins). Puis viennent les volailles d’élevage, les vertébrés sauvages, les carnivores domestiques, les lagomorphes et les oiseaux. Les arthropodes (notamment les tiques) sont à la fois vecteurs (même s’ils ne sont pas indispensables) et réservoirs.

On retrouve sensiblement les mêmes espèces jouant le rôle de réservoirs, auxquelles il faut ajouter le milieu extérieur.

Concernant les matières virulentes, elles peuvent être internes (tissu mammaire, utérus, nœuds lymphatiques, sang principalement) ou externes (produits de la mise bas, lait, urine et fécès, salive de tiques, œufs, sperme, poussières contaminées par les excrétions animales).

48

2.3.2.4. Mode de contamination (figure 5)

2.3.2.4.1. Transmission directe

horizontale :

La contamination transcutanée lors de manipulations au cours de la mise bas, dans les laboratoires ou dans les abattoirs n’induit qu’une séroconversion (36).

La transmission interhumaine est exceptionnelle même si des cas de contamination lors d’autopsies (126, 128) ou lors de l’accouchement de patientes infectées ont été rapportés (77, 126, 128).

La transmission sexuelle a été démontrée expérimentalement chez la souris et Coxiella burnetii a été isolée à partir de semence de taureaux naturellement infectés (116, 117, 126). Elle a également été récemment mise en évidence chez l’Homme : une femme a présenté une fièvre Q aiguë prouvée sérologiquement 15 jours après un rapport sexuel avec son mari qui avait lui-même été infecté lors d’une exposition professionnelle. Coxiella burnetii a été détectée par PCR dans le sperme quatre mois et 15 mois après l’épisode de fièvre Q aiguë (127).

verticale :

Ce mode de transmission a été démontré chez l’animal (117) : chez les tiques, quelle que soit l’espèce, la transmission est à la fois transovarienne et transstadiale (61, 117).

Chez les ruminants, la bactérie est souvent retrouvée dans certains organes du fœtus mais, parfois, à la suite d’une contamination par les enveloppes fœtales maternelles (117).

Chez l’Homme, la voie transplacentaire demeure controversée pour certains auteurs même si des cas ont été rapportés (116, 117, 126, 128), notamment à la suite d’une inoculation transcutanée accidentelle ou d’une transfusion sanguine contaminante (45).

2.3.2.4.2. Transmission indirecte

C’est de loin la modalité de transmission la plus importante du fait de la résistance de Coxiella burnetii dans le milieu extérieur.

L’inhalation de poussières contaminées constitue le principal mode de contamination de l'Homme et est une modalité d’infection importante chez l’animal : la multiplicité des réservoirs, la contamination massive de l'environnement, la résistance de l’agent dans le milieu extérieur, sa forte infectiosité (une bactérie suffit à contaminer l'Homme ou le cobaye) et la dissémination de poussières contaminées par le vent expliquent que les circonstances de la contamination humaine sont multiples. Les individus les plus exposés sont ceux qui ont des contacts professionnels avec les animaux (éleveurs, vétérinaires, marchands de bestiaux, employés d'abattoir, employés de tannerie, scientifiques expérimentant sur les ruminants ou sur Coxiella burnetii directement, militaires en manœuvre ou au combat, employés de tri postal manipulant des sacs transportés dans des wagons à bestiaux...). Ce contact peut également résulter d'activités ludiques et des infections ont été décrites chez des élèves dont l'école élevait des poules et des chèvres (38), chez des étudiants lors d’une visite de ferme dans le cadre scolaire (77), chez des citadins assistant à un part lors d'un séjour à la campagne ou habitant à proximité des routes empruntées par les troupeaux en

49

transhumance ou encore à proximité d’un abattoir, chez des campeurs dormant sur de la paille, chez des individus jouant aux cartes dans une salle où une chatte mettait bas... (38).

La contamination humaine peut aussi se faire par contact direct ou ingestion de matières contaminées : lait cru, fromages fermiers, viandes (128). Chez les ruminants, il a été remarqué que la contamination suivait le rang lorsque les animaux sont élevés à l’attache, ce qui conforte l’idée que la contamination se fait essentiellement par voie orale (ingestion de litière et d’aliments souillés par des produits de la parturition contaminés par Coxiella burnetii,) (36, 117). Les carnivores domestiques et certains oiseaux (corbeaux, corneilles) s’infectent par ingestion de placenta ou de proies infectés (117).

Concernant la transmission par les arthropodes, le point de vue des auteurs diverge :

certaines études indiquent que les tiques ne joueraient qu’un rôle mineur dans la dissémination de Coxiella burnetii au sein des troupeaux de bétail (36, 116) alors que d’autres auteurs estiment que leur rôle serait prédominant dans la transmission inter animale par la dissémination de leurs déjections et de leur salive sous forme d’aérosols ou par morsure, dans la mesure où la bactérie a été isolée à partir de nombreuses espèces de tiques récoltées sur les animaux et ce, sur des régions très étendues (61, 117). Une troisième catégorie d’auteurs, enfin, font le lien entre les deux thèses précédentes : le rôle des tiques serait sans doute plus significatif pour la faune sauvage et notamment pour les rongeurs, oiseaux, marsupiaux et lagomorphes (38, 127). En revanche, concernant le rôle des tiques vis-à-vis de la contamination humaine, le consensus est général : ce rôle, s’il existe, est mineur.

La transmission de Coxiella burnetii peut se faire de façon directe ou indirecte. La transmission directe peut être : - horizontale (par voie transcutanée, sexuelle ou interhumaine de façon exceptionnelle). - verticale : systématique chez la tique (transovarienne et transstadiale), fréquente chez

les ruminants mais controversée chez l’Homme. Le mode de transmission le plus fréquent est le mode indirect :

- inhalation de poussières contaminées. - ingestion de produits à base de lait cru, d’œufs crus, de carcasses contaminés. - ingestion de déjections de tiques (rôle majeur pour le bétail). - morsure de tiques (rôle majeur seulement pour la faune sauvage).

50

2.3.2.5. Voies de pénétration

2.3.2.5.1. Voie respiratoire

Chez l’Homme, c’est la voie de contamination la plus fréquente avec une relation dose-temps d’incubation (128). L’infection n’est alors pas forcément liée une exposition professionnelle, ce qui explique que les zones urbaines ne sont pas à l’abri d’une épidémie (61).

Chez les animaux, c’est aussi une voie de contamination majeure mais la voie orale semble prédominer (36).

2.3.2.5.2. Voie digestive

Chez l’animal, ce mode semble jouer un rôle prédominant dans la transmission entre animaux : par léchage des produits de la parturition ou par ingestion d’aliments souillés ou d’animaux infectés. Ainsi, dans les troupeaux infectés, les chiens de berger et les oiseaux vivant à proximité (corneilles, corbeaux) peuvent ingérer des morceaux de placenta. De plus, les chats se contamineraient en ingérant des souris infectées (117).

En revanche, cette voie a souvent été contestée chez l’Homme (36, 38, 115, 117, 127). Une dose infectante élevée serait requise par voie orale par rapport à la voie aérienne (117). D’autres études montrent que l’ingestion de lait cru contaminé n’entraîne qu’une séroconversion mais pas de forme clinique de la maladie (61). Néanmoins, d’autres auteurs considèrent que la consommation d’œufs crus (126), de produits à base de lait cru ou mal pasteurisés sont des facteurs de risque (77). De plus, la prédominance des formes hépatiques, en France, et leur répartition géographique dans les régions d’élevage font incriminer l’ingestion de lait cru (23, 128).

2.3.2.5.3. Voie cutanée

Chez l’Homme, cette voie de contamination est très probable, même si elle est anecdotique, chez les gens qui manipulent les animaux infectés : les vétérinaires, les éleveurs qui pratiquent un vêlage d’un veau normal ou avorté, ou une délivrance manuelle sur une vache excrétrice, les ouvriers d’abattoir, les techniciens de laboratoire, … (36) . La contamination par voie cutanée a aussi été décrite chez un patient ayant écrasé une tique infectée entre ses doigts (126, 127). L’infection est en général inapparente et ne se traduit que par une séroconversion (36, 127). L’inoculation percutanée, accidentelle en laboratoire ou lors d’une transfusion sanguine, sont également exceptionnelles (38, 127, 128).

2.3.2.5.4. Voie congénitale

C’est chez la tique que cette voie prend toute son importance dans la mesure où la pérennité de l’infection est ainsi assurée de même que l’augmentation de la virulence de l’agent (30, 34). Chez les ruminants, l’infection congénitale provoque la mort du produit (avortement) (30, 112).

Enfin, on peut citer les voies oculaire (34), génitale (116, 117, 126, 127), et intramammaire (infection expérimentale) (82) ; celles-ci sont anecdotiques.

51

Coxiella burnetii peut pénétrer chez son hôte par différentes voies : - la voie respiratoire : c’est la voie prédominante chez l’Homme avec une relation dose/temps d’incubation. Chez les animaux, c’est aussi une voie majeure.

- la voie digestive : c’est la voie prédominante chez les animaux, par léchage ou ingestion (carnivores, oiseaux) des produits de la mise bas, ingestion de proies infectées. Chez l’Homme, cette voie est controversée, la dose infectante requise étant élevée. Cependant, cela peut constituer un facteur de risque sur la base d’arguments géographiques et cliniques.

- la voie cutanée : elle est anecdotique chez l’Homme. - la voie congénitale : c’est une voie importante chez la tique car elle assure la pérennité du cycle infectieux.

52

Figure 9 : diversité des réservoirs et voies de transmission possibles de l’agent de la fièvre Q (115).

Animaux domestiques (R, V, Vic)

brebis, chèvres, vaches, chiens, chats,

lapins, porcs, chevaux, poulets, dindes, oies,

canards, cailles, pigeons, …,

Oiseaux sauvages (R, V) pigeons, moineaux, corbeaux, corneilles, canards, cygnes, …

HUMAIN

Arthropodes (R, V)tiques

poux, mites, mouches Produits de la parturition

FumiersLitières

Produits au lait cru

Commerce Transhumance

Industries (abattoirs, tanneries,

laines)

Inge

stio

n

Aérosols

Aérosols DéjectionsMorsure?

Aérosols(fientes)

Animaux sauvages (R, V, Vic?)

souris, rats, mulots, campagnols,

musaraignes, hérissons, chauve-souris, lièvres, cerfs, élans, chevreuils,

sangliers, babouins, léopards, hyènes, reptiles, tortues,

poissons, …

A

ER

OSO

LS

R: Réservoir ; V: Vecteur ; Vic: Victime 52

53

2.3.3. Epidémiologie synthétique

Pour résumer l’épidémiologie naturelle de la fièvre Q, on peut distinguer deux grands cycles infectieux qui se maintiennent de façon autonome : un cycle pour les animaux sauvages et un pour les animaux domestiques. La circulation de la bactérie parmi les nombreuses espèces sauvages apparaît comme responsable de sa pérennité dans la nature, alors que les animaux domestiques sont impliqués dans un cycle prioritairement à l’origine de la contamination humaine, cible ultime du cycle infectieux. Les tiques seraient des vecteurs à l’intérieur de chacun des deux cycles (117).

2.4. Etude clinique 2.4.1. La maladie animale

2.4.1.1. L’infection expérimentale

chez les bovins (95): L’étude a été menée sur 12 génisses âgées de huit à 11 mois. Coxiella burnetii a été inoculée par voie intradermique. D’abord, on assiste à une phase aiguë, avec hyperthermie et anorexie, 48 heures après l’inoculation, accompagnée de signes respiratoires (tachypnée, jetage, râles). Après une semaine, l’appétit revient mais les signes respiratoires persistent pendant trois semaines sous la forme d’une pneumonie franche. La guérison est spontanée. La croissance des animaux n’est pas altérée par la maladie. Puis, une phase chronique caractérisée par des troubles de la reproduction est observée : après l’insémination des 11 génisses, quatre gestations sont normales, deux génisses avortent à 87 et 124 jours, trois génisses restent vides et les deux dernières sont abattues en cours de gestation (les fœtus avaient un aspect normal). Le nombre de gestations normales est donc de six sur 11 (soit 55%) contre 43 sur 53 (soit 81%) dans un lot témoin. Cette étude a également montré que Coxiella burnetii pouvait être retrouvée dans différents organes et notamment dans les nœuds lymphatiques pendant au moins 20 mois (durée de l’expérience).

chez les animaux de laboratoires : • chez la souris : il semble que l’infection par Coxiella burnetii soit plus sévère chez les

mâles que chez les femelles. Par contre, il n’y a aucune différence entre deux souches différentes de souris infectées par la même voie avec un inoculum identique sauf pour les souches immunodéprimées pour lesquelles la corrélation entre infection et endocardite a été prouvée (105).

De plus, la voie d’administration influe directement sur les symptômes : les lésions respiratoires sont plus marquées après infection par voie intranasale alors que l’on retrouve plus fréquemment des lésions hépatiques, spléniques et pulmonaires après inoculation par voie intrapéritonéale (81).

La maladie se manifeste par de la léthargie, un poil ébouriffé voire la mort. L’étude anatomopathologique met en évidence des lésions pulmonaires, hépatiques et

spléniques avec une splénomégalie apparaissant une à deux semaines post-infection. Dans les poumons, on trouve des lésions d’inflammation interstitielle ou intra-

alvéolaire comprenant de nombreux macrophages. On observe également une prolifération de l’épithélium bronchiolaire associée à une desquamation importante.

54

Les lésions hépatiques sont constituées d’agrégats de cellules mononuclées disséminés dans le parenchyme (90).

• chez le cobaye : cette espèce est très sensible à l’infection (134). L’animal développe de la fièvre en moyenne cinq à huit jours après inoculation par voie intrapéritonéale (45). La voie de contamination détermine les signes cliniques observés (67) : l’inoculation par voie intrapéritonéale entraîne préférentiellement une atteinte hépatique (avec hépatomégalie et infiltration graisseuse (90)) alors que par voie intranasale, on observe une pneumopathie interstitielle. De plus, les cobayes porteurs d’une lésion valvulaire inoculés par voie intrapéritonéale développent une endocardite (66) voire une myocardite lorsque l’on augmente la taille de l’inoculum (67).

2.4.1.2. L’infection naturelle

Coxiella burnetii peut être responsable de l’infection d’un large nombre d’espèces animales incluant les espèces de rente. L’infection demeure souvent inapparente (80). La fièvre Q animale se manifeste par des symptômes frustes exprimés uniquement chez les femelles des mammifères infectés : avortements, mortinatalités, mises bas prématurées, naissances d’animaux chétifs, spécialement chez les ovins et les caprins. Ces manifestations cliniques seraient plus occasionnelles chez les bovins où l’on rencontre plutôt des métrites et de l’infertilité (4). - chez les petits ruminants : la maladie s’exprime essentiellement par des avortements, pendant le dernier mois de gestation, sans signe clinique précurseur ou par la mise bas, prématurée ou à terme, d’agneaux ou de chevreaux chétifs (112, 113). Néanmoins, les avortements peuvent parfois être précoces chez la chèvre (117) : ils ont lieu avant le 100ème jour de gestation et passent souvent inaperçus (112). On retrouve des lésions placentaires dans les zones intercotylédonaires et parfois des lésions vasculaires (117). Un examen soigneux du fœtus avorté peut révéler la présence de pétéchies sur la peau des membres, de la tête et du cou ainsi que l’existence d’œdèmes sous-cutanés. A l’autopsie, on observe fréquemment des épanchements clairs ou hémorragiques dans les grandes cavités ainsi qu’une hépatomégalie. L’examen microscopique révèle de nombreux foyers de nécrose sur le foie associés à une infiltration diffuse de macrophages dans le parenchyme pulmonaire (112). Après l’avortement, les femelles se rétablissent rapidement et les gestations suivantes se déroulent normalement (113) sauf en cas de mort fœtale ou de rétention placentaire où des surinfections bactériennes peuvent provoquer des métrites, mortelles dans un très petit nombre de cas (112). Suite à l’infection, la réponse sérologique se met en place et persiste pendant six à dix mois chez la brebis et pendant six mois chez la chèvre (115). En revanche, il ne semble pas y avoir de phénomène de latence ni chez la chèvre, ni chez la brebis (117).

- chez les bovins : l’infection peut rester à l’état latent pendant plusieurs années (115, 117). La maladie peut occasionnellement entraîner des pneumonies mais les avortements dominent le tableau clinique (112). Ils surviennent en fin de gestation (à partir du sixième mois). Plus ils sont précoces, plus les lésions placentaires sont prononcées. En général, le fœtus expulsé est mort. Vers le huitième mois, il peut être expulsé vivant mais n’est pas viable (30). Alors que les complications sont très rares (112), les métrites et les troubles de la reproduction sont fréquents mais semblent précéder l’apparition des avortements à Coxiella burnetii dans un élevage. Les métrites sont parfois chroniques mais, la plupart du temps,

55

elles sont aiguës et surviennent aussi bien après une parturition et une délivrance normales qu’après une rétention du placenta ou un avortement. Si la délivrance doit être effectuée manuellement, elle s’avère souvent délicate car les cotylédons sont nécrotiques. Le placenta se présente parfois épaissi et induré, parfois œdémateux avec des enveloppes gélatineuses. Le mucus est très abondant, en général violacé et marron, puis épais et jaunâtre. Ces endométrites durent plusieurs semaines mais évoluent vers la guérison avec une thérapeutique énergique (30). Les veaux nés normalement de mères infectées présentent souvent dès le troisième jour des troubles généraux avec faiblesse, anorexie, dysenterie et déshydratation puis, parfois, pneumonie et arthrite. L’évolution vers la mort est rapide en l’absence de traitements intensifs (30). Chez les bovins, la réponse sérologique persiste plus longtemps que chez les petits ruminants : un suivi conduit pendant 28 mois sur 290 vaches infectées a montré que 47% des animaux sont restés séropositifs pendant toute la durée de l’expérience (115).

L’inoculation intradermique expérimentale de Coxiella burnetii, chez les bovins, se traduit par : - une phase aiguë : hyperthermie, anorexie et signes respiratoires. La guérison est spontanée.

- une phase chronique : troubles de la reproduction (avortements et infertilité). Chez les animaux de laboratoire, l’infection expérimentale se traduit :

- chez la souris, par de la léthargie, un poil ébouriffé et la mort. Les mâles ainsi que les souches immunodéprimées sont plus sensibles. Les lésions se localisent dans les poumons, le foie et la rate. De plus, on observe une corrélation entre la voie d’inoculation et les territoires lésés.

- chez le cobaye, par de la fièvre au bout de cinq à huit jours. Les animaux porteurs de lésions valvulaires développent une endocardite voire une myocardite lorsque la taille de l’inoculum augmente. Comme chez la souris, le voie d’inoculation conditionne la localisation des lésions.

L’infection naturelle touche de nombreux animaux. Chez le bétail, l’infection est souvent inapparente. Les symptômes sont frustes et ne s’expriment que chez les femelles : avortements en fin de gestation, sans prodrome ni complication, mortinatalité, mises bas prématurées, naissances d’animaux chétifs. Chez les bovins, on observe plutôt des métrites et de l’infertilité.

56

2.4.1.3. Diagnostic

2.4.1.3.1. Diagnostic direct

par isolement : il est rarement utilisé en médecine vétérinaire de routine du fait des contraintes de prélèvements (ils doivent être effectués sans contamination) et de réalisation (nécessité d’avoir accès à un laboratoire de type L3) (112). De plus, le résultat obtenu, même s’il est la preuve irréfutable de l’infection, est tardif (116). L’isolement présente néanmoins un intérêt épidémiologique car il permet de suivre une souche responsable d’une épidémie et de comparer les caractéristiques des souches isolées chez les animaux, chez l’Homme, voire chez des arthropodes présents dans un même secteur géographique (116).

par mise en évidence directe : elle peut être réalisée à partir d’une empreinte ou d’une coupe de placenta, des organes de l’avorton ou d’un prélèvement vaginal, par coloration de Machiavello, de Stamp ou de Gimenez. Cependant, la qualité des prélèvements est cruciale : ils doivent être effectués le plus stérilement possible de façon à éviter les contaminations extérieures et être acheminés rapidement (24 à 48 heures à 4°C ou congelés si le délai est plus long) vers le laboratoire (116). De plus, l’interprétation est délicate, compte tenu de la taille de Coxiella burnetii et des nombreuses confusions possibles avec d’autres bactéries (Brucella sp., Chlamydia sp., par exemple) (112). L’immunodétection directe dans les tissus par immunofluorescence ou immunopéroxydase permet d’améliorer considérablement la sensibilité et la spécificité du diagnostic et même de différencier les souches bactériennes. Malheureusement, cette technique n’est pas utilisée en routine car les anticorps utilisés ne sont pas commercialisés (116).

par Polymerase Chain Reaction (PCR) : cette technique est rapide, sensible, spécifique et réalisable à partir de n’importe quel type de prélèvement. Cependant, elle est encore, à l’heure actuelle, trop onéreuse. Le développement d’une technique de PCR quantitative permettrait de réduire considérablement le coût de l’examen. On peut également espérer voir apparaître, un jour, une technique de PCR multiplex, avec des amorces permettant l’amplification simultanée de l’ADN de plusieurs microorganismes responsables d’avortements. Cela représenterait un atout important dans le diagnostic différentiel des avortements infectieux chez les ruminants (116).

2.4.1.3.2. Diagnostic indirect

La réaction de fixation du complément est la technique la plus employée en médecine vétérinaire. C’est aussi celle reconnue par l’OIE (116).

La recherche des anticorps doit être effectuée sur le sérum, la recherche sur lait individuel ou lactosérum devant être réservée au dépistage (35). Le seuil diagnostic sur sérum est de 1 : 80 dans un contexte abortif. Entre 1 : 40 et 1 : 80, soit l’animal est vacciné, soit l’infection est latente. Une analyse réalisée le jour ou dans les jours qui suivent l’avortement peut se révéler négative, la montée du titre des anticorps ne s’étant pas encore produite. Il faut donc faire des prélèvements sur les animaux les plus anciennement avortés ou apprécier la cinétique des anticorps par deux sérologies à au moins dix jours d’intervalle (97).

Cependant, même en prenant ces précautions, on peut obtenir de faux résultats car les brebis et les chèvres peuvent avorter et excréter massivement des Coxiella avec un titre en anticorps fixant le complément très faible ou même négatif et sans qu’aucun animal, dans le

57

troupeau, n’ait de titre supérieur ou égal à 40. Ceci provient du fait que cette technique est moins sensible et moins spécifique que l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou l’immunofluorescence indirecte (116). D’autre part, aucune corrélation entre l’excrétion et la réponse sérologique n’a pu être démontrée : un animal séropositif n’est pas obligatoirement excréteur, de même que certains animaux sont excréteurs alors que leur taux d’anticorps est faible (115).

De plus, la fixation du complément ne permet de déterminer que le taux d’anticorps anti-Coxiella burnetii de phase II (116).

2.4.1.4. Traitement

chez les petits ruminants : l’utilisation de tétracyclines sous forme injectable est efficace. Cependant, pour des raisons économiques, les protocoles de traitements antibiotiques utilisés dans les troupeaux ovins et caprins permettent de diminuer le nombre d’avortements, mais pas l’excrétion des bactéries, ni l’infection dans le troupeau (8, 9, 112, 115, 116). Néanmoins, lors d’une enzootie d’avortements à fièvre Q, un traitement préventif doit être instauré sur les brebis gestantes non encore avortées. Un traitement métaphylactique est possible avec l’oxytétracycline injectable à la dose de 10 mg/kg de poids vif. Les injections doivent être renouvelées tous les sept à dix jours jusqu’à la mise bas (96). Un autre protocole peut être également préconisé : il consiste en deux injections intramusculaires de tétracycline retard à raison de 20 mg/kg à 15 jours d’intervalle. L’efficacité de ce protocole n’a pas été contrôlée en condition expérimentale, mais lors de l’infection naturelle du troupeau d’ovins de l’Unité de Pathologie Infectieuse et d’Immunologie de Tours, il a été constaté que ce traitement, s’il n’empêche pas l’excrétion, pourrait la réduire lors des gestations suivantes (113).

chez les bovins : le traitement des bovins dans un cheptel atteint pourrait s’avérer

efficace s’il est effectué assidûment. Préventivement, les vaches gravides n’ayant pu être vaccinées reçoivent des injections répétées d’oxytétracycline (et au besoin de progestérone), avec une fréquence variant en fonction de l’intensité de l’infection et des résultats sérologiques. Les risques d’avortement, le nombre et l’intensité des métrites, ainsi que la morbidité des veaux semblent alors nettement réduits. Curativement, les meilleurs résultats ont été obtenus avec les tétracyclines et en particulier avec l’oxytétracycline. Les femelles présentant des métrites ou ayant avorté sont isolées et reçoivent des injections parentérales d’antibiotiques, associées surtout à des injections intra-utérines fréquentes d’oxytétracycline, alternées avec des irrigations antiseptiques ; ces soins locaux sont effectués durant trois à cinq semaines. Les guérisons sont, semble-t-il, fréquentes, et l’utérus redevient normal. L’animal est alors vacciné et inséminé, et la gestation puis la parturition se passent normalement, et, apparemment, sans excrétion de Coxiella burnetii (30).

58

Le diagnostic de la fièvre Q animale peut être réalisé de façon directe ou indirecte. Le diagnostic direct peut se faire :

- par isolement : les résultats sont certains mais tardifs et cela nécessite un laboratoire de niveau de biosécurité 3.

- par coloration de Machiavello, Stamp ou Gimenez : il y a risque de confusion avec d’autres espèces bactériennes.

- par PCR : cette méthode est rapide, sensible et spécifique mais encore trop onéreuse aujourd’hui.

Le diagnostic indirect fait appel le plus fréquemment à la technique de fixation du complément, pratiquée sur le lait ou sur des sérums appariés. L’interprétation est cependant délicate car la sensibilité et la spécificité sont moyennes. De plus, il n’y a pas toujours de corrélation entre séropositivité et excrétion.

Le traitement faisant appel aux tétracyclines et en particulier à l’oxytétracycline est efficace mais les protocoles utilisés, s’ils réduisent l’incidence clinique, ne modifient pas le niveau d’excrétion. En cas d’enzooties, il est possible d’administrer ces antibiotiques aux femelles non encore avortées, à intervalles réguliers, jusqu’à la mise bas.

2.4.2. La maladie humaine

Chez l’Homme, la fièvre Q se caractérise par un grand polymorphisme clinique : elle peut être asymptomatique (60% des cas (77)), ou se manifester par une forme aiguë ou chronique qui nécessitera une hospitalisation pour 5% des patients symptomatiques. Les cas de formes chroniques représentent 10% des cas hospitalisés (et 0,2% du total des cas) (77).

La période d’incubation est de 20 jours en moyenne mais peut s’étendre à deux mois (105). Cette durée varie en fonction du nombre de microorganismes infectant le patient (16).

2.4.2.1. La forme aiguë

L’infection survenant le plus souvent par voie aérienne ou digestive, les premières cibles de la bactérie sont les macrophages alvéolaires dans les poumons et les cellules de Küpfer dans le foie. Elle envahit ensuite l’organisme et on la retrouve dans les monocytes du sang ainsi que dans de nombreux organes (rate, moelle osseuse, foie, ganglions, pancréas, cœur,…) (117).

Près de la moitié des cas passent inaperçus, car cette forme comporte des signes très banals dans 40% des cas (rhume, pseudo-grippe…). Elle n’est véritablement sévère que dans 5 à 10% des cas (101).

En règle générale, le début de la maladie comprend une fièvre marquée (>39°C), d’apparition brutale accompagnée de frissons, de sueurs et associée à une asthénie importante et à de l’anorexie. A cela s’ajoutent de violentes céphalées frontales et rétro-orbitaires ainsi que des myalgies (105).

La phase d’état peut être divisée schématiquement en trois formes principales : syndrome pseudo-grippal : c’est la présentation clinique la plus fréquente. Elle se

caractérise par une fièvre modérée à sévère (>40°C), des céphalées, des myalgies. L’asthénie peut être majeure obligeant le patient à rester au lit.

Les symptômes durent en moyenne dix jours mais cette durée augmente avec l’âge ; et jusqu’à 28% des patients rechutent (45, 105).

pneumopathie : la plupart des cas sont asymptomatiques ou bénins, caractérisés par une toux non productive, de la fièvre et quelques râles crépitants à l’auscultation.

59

Dans certains cas, l’atteinte pulmonaire peut être sévère et entraîner une hypoxie majeure voire un syndrome de détresse respiratoire aiguë (45, 105). On constate parfois une hémoptysie ainsi que des douleurs thoraciques, témoins d’une pleurésie (105).

La durée des symptômes varie de dix à 90 jours et le taux de mortalité de 0,5 à 1,5% (45, 105).

La radiographie du thorax montre des images non spécifiques de pneumopathie interstitielle mais parfois, on peut observer des images franches de pneumonie lobaire aiguë. Les images apparaissent vers le quatrième jour de la maladie, dans la région hilaire et dans les lobes inférieurs (105).

L’étude anatomopathologique met en évidence des lésions macroscopiques d’hépatisation rouge ou grise du poumon. Au plan microscopique, on retrouve fréquemment un œdème interstitiel ainsi que des infiltrats lymphocytaires et macrophagiques. Les espaces alvéolaires sont remplis d’histiocytes et l’on rencontre parfois des foyers de nécrose alvéolaire focale de même que des lésions de bronchite ou de bronchiolite nécrosante (45, 105).

hépatite : trois formes principales sont rencontrées (45, 105):

• une fièvre prolongée associée à des granulomes caractéristiques sur la biopsie hépatique.

• une forme aiguë simulant une hépatite A, avec hépatomégalie, douleur de l’hypocondre droit, nausées, vomissements et parfois ictère.

• une forme asymptomatique marquée par des perturbations biologiques isolées.

Sur le plan biologique, on note fréquemment une leucocytose (de 14.109 à 21.109/L dans 25% des cas (45)), une thrombopénie (25% des cas (45)), une augmentation des transaminases (85% des cas (105)). Les gammaglutamyl transférases (γGT) sont également augmentées dans 75% des cas ainsi que les phosphatases alcalines (PAL) dans 30% des cas (105). Le taux de bilirubine n’augmente que dans 5 à 10% des cas (105).

Les lésions anatomopathologiques sont très typiques et l’on observe dans presque tous les cas des lésions granulomateuses formées d’histiocytes et de cellules épithélioïdes. Un anneau de fibrine entourant le granulome est visible ainsi qu’une vacuole lipidique centrale donnant à cette lésion un aspect caractéristique « en beignet » (24). Quelques cellules géantes peuvent être observées et accessoirement du matériel granulaire évocateur de corps bactériens (105).

Les granulomes sont plus souvent en position lobulaire que périportale. Leur taille est très variable (105).

A ces trois formes s’ajoutent, plus rarement, des manifestations :

- cutanées (exanthème dans 10% des cas (45)). - neurologiques (méningite aseptique éventuellement compliquée d’encéphalite dans 0,2 à

1,3% des cas (45), méningoencéphalite(105)). - hématologiques (splénomégalie, adénopathie, thrombopénie modérée). - cardiovasculaires (péricardite, myocardite). - rénales (leucocyturie modérée, protéinurie, insuffisance rénale modérée). - locomotrices (myalgies avec augmentation des créatine phosphokinases, arthralgies

simples, arthrite séreuse) (105). Les formes aiguës ont un bon pronostic. La fièvre et les signes cliniques disparaissent en

deux semaines, en général. Certains patients présentent néanmoins une fièvre prolongée ainsi

60

qu’une asthénie résiduelle chronique invalidante et rebelle à tout traitement. En France, 5-10% des patients présentent ce symptôme et ce, jusqu’à six mois après le début de la maladie (100).

Quelques cas mortels ont été observés, en particulier chez les insuffisants respiratoire ou en cas de myocardite. Des rechutes peuvent être observées notamment chez les patients non traités (105).

2.4.2.2. La forme chronique

Il s’agit de cas de fièvre Q évoluant depuis plus de six mois. Elle représente environ 5% des cas diagnostiqués et se développe de façon insidieuse dans les mois ou années suivant la forme aiguë (45, 105).

Dans les formes chroniques, on observe une bactériémie permanente entraînant un taux élevé et persistant d’anticorps (45) sans possibilité d’élimination spontanée (41). La forme clinique la plus fréquente est l’endocardite (60 à 70% des cas (44)), suivie des infections d’anévrysmes et de prothèses valvulaires, des infections osseuses et hépatiques.

endocardite : l’incidence des endocardites à Coxiella burnetii est sous estimée, elles pourraient représenter jusqu’à 17% des cas d’endocardites infectieuses au lieu des 3% estimés jusqu’à présent (43).

Elle peut survenir jusqu’à 20 ans après une fièvre Q aiguë. Les patients atteints sont, en règle générale, des hommes (75% des cas) d’âge adulte (le risque est multiplié par cinq entre 60 et 69 ans d’âge (24)), porteurs d’une valvulopathie (88,5% des cas (24)) ou immunodéprimés (cancer, corticothérapie, sidéens, hémodialysés, splénectomisés, femmes enceintes (105), maladie de Crohn, maladie d’Hodgkin, leucémie, etc) (61).

La phase de début est insidieuse. Le patient valvulopathe présente une altération de l’état général avec une asthénie progressive, un amaigrissement, un syndrome infectieux ou inflammatoire inexpliqué, une décompensation cardiaque, une hépatomégalie, une insuffisance rénale, une éruption cutanée ou un phénomène embolique (105).

Après quelques semaines ou quelques mois d’évolution, on observe des manifestations générales dominées par l’asthénie, l’anorexie et l’amaigrissement (la fièvre n’est le signe d’appel que dans 61% des cas).

En ce qui concerne les manifestations cardiovasculaires, un souffle peut apparaître ou se modifier et surtout, on assiste à une décompensation cardiovasculaire progressive dont le premier signe est une tachycardie permanente. Les embolies infectieuses sont fréquentes (les embolies artérielles compliquent environ 20% des endocardites à Coxiella burnetii (24, 45)) et sont souvent révélatrices de la maladie, elles peuvent se situer au niveau des artères cérébrales ou des artères des membres (24, 105).

Les signes radiologiques et électrocardiographiques ne sont pas spécifiques, ils témoignent seulement de l’insuffisance cardiaque (105).

L’échocardiographie est aussi souvent en défaut : les valves cardiaques apparaissent souvent normales. Lorsqu’elles sont présentes, les végétations ont un aspect nodulaire et une surface lisse (24).

Les lésions concernent de façon équivalente soit les valves mitrales soit les valves aortiques mais rarement les valves tricuspides (24).

C’est en général l’examen anatomopathologique des valves, après remplacement valvulaire ou post mortem qui permet de confirmer le diagnostic (105). On observe alors des lésions mixtes d’inflammation aiguë et chronique, des dépôts de fibrine, des foyers de fibrose et de nécrose. Coxiella burnetii peut être mise en évidence, mais la bactérie se situe exclusivement dans les macrophages présents dans les foyers lésionnels (24).

61

D’autre part, on peut observer, lors d’endocardite, des manifestations abdominales se traduisant par une hépatomégalie d’autant plus marquée que le diagnostic est tardif (57) : le foie est dur et évoque un foie cirrhotique (105). A l’examen histologique, on peut observer des granulomes similaires à ceux observés lors de la forme aiguë (24). Le suivi de l’hépatomégalie est un excellent paramètre de surveillance, car, en un à deux mois après la mise en place du traitement, il retrouve sa taille initiale (105).

Une splénomégalie, plus ou moins importante en fonction du délai diagnostique, peut également être mise en évidence (57) et faire évoquer une maladie hématologique (105).

Un cinquième des patients présente un rash cutané, souvent localisé aux extrémités du corps et aux muqueuses. Les biopsies cutanées révèlent des lésions de vascularite à complexes immuns (24).

L’évolution est largement dépendante du délai diagnostique (12 à 24 mois (45)), de

l’état cardiovasculaire et de la constance thérapeutique. Au Centre National de Référence pour l’Etude des Rickettsioses (CNR), la létalité globale est passée de 60% à 5% au cours des dix dernières années grâce à l’amélioration de la prise en charge des patients tant au plan diagnostique (le délai a été ramené de 18 à six mois (57)) que thérapeutique (105).

infections d’anévrysmes et de prothèses vasculaires : peu de cas ont été rapportés du

fait de la symptomatologie aspécifique mais l’incidence est sans doute sous-estimée (44). Le diagnostic est obtenu par sérologie, culture et amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) systématiques des fragments issus de biopsies vasculaires (105).

hépatopathies chroniques : plusieurs cas d’hépatite chronique compliquée de fibrose et

de cirrhose ont été rapportés (45, 105).

2.4.2.3. Fièvre Q et terrain favorisant

fièvre Q et immunodépression physiologique (grossesse) : il s’agit d’une forme sévère du fait du contexte d’immunodépression dans lequel elle survient et surtout de ses conséquences fœtales. Deux tiers des cas se compliquent de mort fœtale in utero ou de prématurité (105). La gravité des symptômes dépend du moment où l’infection est contractée : une infection durant le premier trimestre de la grossesse conduit souvent à l’avortement alors qu’une infection lors du second semestre entraîne plutôt un accouchement prématuré (106).

De plus, une infection par Coxiella burnetii en cours de grossesse augmente les risques de développer une fièvre Q chronique (106) ; ce risque est estimé à deux tiers des femmes infectées (104). En outre, il augmente encore si l’infection est contractée en début de grossesse (106).

Il existe également un risque important de contamination du personnel de la salle d’accouchement par des aérosols infectés. En l’absence de traitement correct, les rechutes lors de grossesses ultérieures sont fréquentes, d’où la nécessité de proposer à la patiente un traitement antibiotique pendant toute la grossesse (105).

fièvre Q et immunodépression pathologique : chez les immunodéprimés, l’infection

peut parfois être très ancienne et être réactivée à l’occasion d’une modification des défenses immunitaires. Tout état d’immunodépression peut favoriser le développement de Coxiella burnetii. La maladie se manifeste alors comme une forme chronique (105).

62

fièvre Q aiguë chez des patients porteurs d’une valvulopathie ou d’une anomalie aortique : les anomalies valvulaires ou vasculaires constituent des facteurs de risque de fièvre Q chronique (105). On estime que 39% des patients atteints d’une infection aiguë et porteurs d’une valvulopathie développeront une endocardite dans les deux ans. Ce risque passe même à 75% chez les patients non traités (77).

La fièvre Q humaine présente un grand polymorphisme clinique. La majorité des patients sont asymptomatiques, sinon ils développent une forme aiguë ou chronique. Concernant la forme aiguë, la période d’incubation dure 20 jours en moyenne, puis l’on observe soit : - un syndrome pseudo-grippal : fièvre, céphalées, asthénie, myalgies. - une pneumopathie : fièvre, toux, atteinte pulmonaire pouvant aller jusqu’à la détresse respiratoire aiguë.

- une hépatite : asymptomatique, aiguë ou granulomateuse. Le pronostic de la forme aiguë est bon et la guérison intervient en deux semaines.

La forme chronique, elle, se développe de façon insidieuse dans les mois voire les années suivant une forme aiguë. La forme la plus fréquente est l’endocardite, suivie de l’infection d’anévrysme ou de prothèse vasculaire et des hépatopathies chroniques. Le statut immunitaire du patient est fondamental ; en effet, tout état d’immunodépression (grossesse, cancers, infection par le virus du SIDA) favorise l’apparition d’une forme chronique. De même, il existe une étroite corrélation entre valvulopathie et endocardite à Coxiella burnetii.

2.4.2.4. Diagnostic

2.4.2.4.1. Diagnostic direct

Du fait de la virulence de Coxiella burnetii, le diagnostic direct ne peut être réalisé que dans des structures spécialisées, équipées de pièces de travail ayant un niveau de confinement 3. La recherche peut être effectuée sur sang hépariné, moelle osseuse, liquide céphalorachidien (LCR), lait, placenta, biopsies de foie, de valve cardiaque, d’aorte ou de fœtus en cas d’avortement (105).

immunodétection dans les tissus : cette technique est particulièrement intéressante chez les patients suivant un traitement contre la fièvre Q chronique. Plusieurs techniques sont utilisables : immunoperoxydase, ELISA/ELIFA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay / Enzyme-Linked Immunosorbent Fluorescence Assay) et anticorps monoclonaux (45, 105).

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Figure 10: Coxiella burnetii mise en évidence par immunohistochimie à partir d’un prélèvement valvulaire chez un patient atteint d’endocardite. Grossissement x 600 (24).

amplification par PCR : cette méthode est très sensible et spécifique, elle peut être employée pour l’amplification génique dans du sang prélevé sur éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA), les cultures cellulaires, des échantillons tissulaires inclus en paraffine ou congelés à -80°C. Les amorces d’amplification utilisées sont multiples et les plus spécifiques sont dérivées du gène codant la zone intergénique entre les fractions de 16 à 23 S de l’ARN ribosomal, et du gène codant la superoxyde dismutase (105).

culture cellulaire : l’isolement de Coxiella burnetii peut être réalisé sur culture cellulaire (fibroblastes d’embryon humain (77)), sur le sac vitellin d’un œuf embryonné ou sur cobaye. La technique la plus utilisée actuellement est l’inoculation à des systèmes de culture cellulaire en tube « bijou » (annexe 5). L’isolement de Coxiella burnetii peut se faire à partir du sang hépariné ou de biopsies tissulaires. La vérification de la croissance bactérienne se fait à l’aide de la coloration de Gimenez et l’identification en culture cellulaire fait appel à une détection par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps anti-Coxiella burnetii poly- ou monoclonaux conjugués à la fluorescéine ou par PCR (105). Les résultats sont obtenus en six jours (77).

Bien que cette technique soit de moins en moins utilisée, elle n’en demeure pas moins utile notamment pour isoler Coxiella burnetii à partir de prélèvements contaminés par plusieurs espèces bactériennes ou pour obtenir des antigènes de phase I à partir de bactéries de phase II (45).

2.4.2.4.2. Diagnostic indirect

Le manque de spécificité des symptômes de la fièvre Q oblige souvent le clinicien à avoir recours à la sérologie. De nombreuses techniques ont été utilisées : microagglutination, réaction de fixation du complément, radio-immunoassay, immunofluorescence indirecte, test d’hémolyse indirecte, ELISA, ELIFA, dot-immunoblotting et western immunoblotting.

Parmi celles-ci, les techniques les plus fiables et les plus utilisées sont l’immunofluorescence indirecte, la réaction de fixation du complément, l’ELISA et la microagglutination. Toutefois, seules les deux premières sont commercialisées et utilisables en pratique de routine (45, 105).

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immunofluorescence indirecte : il s’agit actuellement de la technique de référence pour le sérodiagnostic de la fièvre Q (45). En effet, elle est très spécifique et il n’existe pas de réaction croisée (23). En dépistage, l’antigène utilisé est la souche de référence Nine Mile de phase II cultivée sur fibroblastes de souris L929. Cette méthode de préparation des antigènes est celle qui permet d’obtenir la meilleure sensibilité de détection des anticorps dirigés contre Coxiella burnetii, les sérums positifs étant étudiés pour les deux phases antigéniques. Il est intéressant d’étudier les immunoglobulines (Ig) G, M et A et ceci conduit à la réalisation de six examens par sérum, ce qui est assez lourd (105). Il est indispensable d’éliminer les Ig G avant d’étudier les Ig A et les Ig M. Cela permet d’éliminer le facteur rhumatoïde responsable de faux positifs en Ig M et d’éviter les faux négatifs (en particulier Ig A) par saturation des sites antigéniques par les Ig G. La réalisation complète de cette réaction permet sur un sérum unique le diagnostic de forme aiguë ou chronique. Les Ig M sont détectées jusqu’à 17 semaines après le début de la maladie (105). Les seuils sérologiques pour le diagnostic de fièvre Q aiguë sont de 1 : 200 pour les Ig G anti-phase II et 1 : 50 pour les Ig M anti-phase II (45, 77). Toutefois de tels titres peuvent être obtenus tardivement et on estime que seuls 10% des malades ont des titres significatifs dans la deuxième semaine suivant l'apparition des symptômes alors que pour 50% des malades, ces titres sont obtenus au cours de la troisième semaine et pour 70% des malades au cours de la quatrième semaine. Si le titre en Ig G est inférieur à 100, une infection par Coxiella burnetii est considérée comme improbable et peut être totalement écartée si un deuxième sérum, prélevé 45 jours après l'apparition des symptômes est également négatif. Quand des titres intermédiaires sont obtenus, l'interprétation nécessite l'examen d'un deuxième sérum prélevé 15 jours après le premier (38). Pour la fièvre Q chronique, le seuil est de 1 : 800 pour les Ig G anti-phase I (valeur prédictive positive de 98%) et un titre supérieur ou égal à 1 600 donne une certitude. Dans les formes chroniques, les titres en Ig A anti-phase I sont généralement supérieurs ou égaux à 100. La détermination des titres en Ig A est toutefois moins utilisée qu'auparavant pour le diagnostic des formes chroniques (38, 57).

réaction de fixation du complément : elle permet, sous condition d’une réalisation technique parfaite, de rechercher les anticorps de phase II et de phase I. Elle présente néanmoins les inconvénients inhérents à la technique : délai d’apparition relativement tardif (dix à 15 jours après le début de la maladie), nécessité absolue d’obtenir une paire de sérums afin d’interpréter un résultat, sensibilité insuffisante (85% des cas dépistés par immunofluorescence) (105). Le titre seuil en anticorps anti-phase II pour le diagnostic de fièvre Q aiguë est de 1 : 40 (77). Dans les endocardites, la sensibilité est bonne, mais un phénomène de prozone peut parfois être observé et conduire à une interprétation erronée (faux négatif) (105). Le titre seuil en anticorps anti-phase I pour le diagnostic des formes chronique est de 1 : 200 (77).

ELISA : cette méthode donne des résultats comparables à ceux obtenus par immunofluorescence indirecte (105) (sensibilité de 94% (110)). Cette technique est intéressante dans les études épidémiologiques (61). Les valeurs seuils sont 1 : 128 pour les Ig M et les Ig G de phase I, de 1 : 512 pour les Ig M de phase II et de 1 : 1024 pour les Ig G de phase II (61).

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microagglutination : seule la microagglutination sur tube reste utilisée, elle détecte essentiellement les Ig M (105). Il s’agit d’une technique sensible (81,6%), spécifique (98,6%), simple à mettre en œuvre et permettant une détection précoce de la réponse anticorps. Par contre, cette technique nécessite une grande quantité d’antigènes pour sa réalisation, ce qui limite son utilisation (45).

Interprétation des résultats :

dans les formes aiguës, les Ig M de phase II apparaissent vers le dixième jour pour culminer vers la quatrième semaine et disparaître vers le quatrième mois. Les titres obtenus sont souvent inférieurs à 400. Les Ig M de phase I apparaissent un peu plus tard et restent souvent inférieures en titre à celles de phase II (105). Par contre, elles persistent plus longtemps (plus de deux ans) (110). Les Ig G de phase II apparaissent très rapidement après les Ig M et persistent plusieurs années à des titres élevés. Les Ig G de phase I ne s’élèvent pas ou de façon tardive et leur titre reste très inférieur à celui des Ig G de phase II. Les Ig A de phase II sont inconstantes et précoces. Il n’y a pas, en règle générale, d’Ig A de phase I (105).

dans les endocardites, on observe la présence, à des titres élevés (toujours supérieurs à 800 en immunofluorescence et à 200 en fixation du complément) d’Ig G de phases I et II ; les Ig M sont inconstantes ; on note la présence d’Ig A de phases I et II. Les titres obtenus sont souvent considérables en Ig G. Le suivi sérologique des patients montre parfois des fluctuations très importantes des titres. Deux ans après le début du traitement, les anticorps sont encore présents à des titres souvent élevés (105).

Tableau VII: seuils sérologiques pour le diagnostic de la fièvre Q en immunofluorescence indirecte et par la réaction de fixation du complément (45, 77).

Immunofluorescence indirecte

(titre) Fixation du complément

(titre) Anti-phase I

Anti-phase II

Forme de la maladie

Ig G Ig M Ig A Ig G Ig M Anti-phase I Anti-phase II

Aiguë

1 : 200 1 : 50 1 : 40

Chronique 1 : 800

1 : 100

1 : 200

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Le diagnostic de la fièvre Q humaine peut être réalisé par des méthodes directes et indirectes.

Le recours à des méthodes directes nécessite des conditions de biosécurité de niveau 3. Les techniques utilisables sont : - l’immunodétection dans les tissus : on l’utilise surtout dans le suivi du traitement de la forme chronique.

- l’amplification par PCR : cette méthode est rapide, sensible et spécifique. - la culture cellulaire : elle est utile pour isoler Coxiella burnetii à partir de prélèvements polycontaminés ou pour obtenir des antigènes de phase I.

Les techniques indirectes sont les méthodes les plus utilisées : - l’immunofluorescence indirecte : c’est la méthode de référence, elle est spécifique et il n’y a pas de réaction croisée. Les seuils de positivité sont :

¤ pour la forme aiguë : 1/200 pour les Ig A phase II. 1/50 pour les Ig M phase II.

¤ pour la forme chronique : 1/800 pour les Ig G phase I. - l’ELISA : les résultats obtenus sont comparables à ceux de l’immunofluorescence indirecte, l’ELISA est surtout utilisée pour les études épidémiologiques.

- la fixation du complément : l’apparition des anticorps fixant le complément est tardive et la sensibilité est faible. Les seuils de positivité sont :

¤ pour la forme aiguë : 1/40 pour les anticorps anti-phase II. ¤ pour la forme chronique : 1/200 pour les anticorps anti-phase I.

- la microagglutination : sensible, spécifique et simple, la détection est précoce mais nécessite une grande quantité d’antigènes.

2.4.2.5. Traitement

Du fait de l’étiologie, le traitement repose sur l’antibiothérapie. Pour être actif vis-à-vis de Coxiella burnetii, l’antibiotique utilisé doit pénétrer dans les cellules, se concentrer dans les phagolysosomes et rester actif à un pH inférieur à 5 (122).

In vitro, Coxiella burnetii est sensible à la doxycycline, à la rifampicine, au cotrimoxazole et à la clarithromycine. Les quinolones, le chloramphénicol, la ceftriaxone et l’acide fusidique ont une efficacité variable (24).

2.4.2.5.1. Forme aiguë

Lors de fièvre Q aiguë, un simple traitement bactériostatique est suffisant (38) surtout s’il est mis en place dans les trois premiers jours de la maladie (16). La doxycycline apparaît comme étant le traitement de choix, elle est administrée à la dose de 200 mg par jour en deux prises pendant 15 à 21 jours (16, 103). En cas de rechute, le traitement doit être prolongé (16). Dans les cas où les tétracyclines sont contre-indiquées, on peut utiliser la rifampicine à la dose de 600 mg par jour pendant trois semaines (102).

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2.4.2.5.2. Forme chronique

Jusqu’à récemment, le traitement recommandé faisait appel à l’association doxycycline-quinolone pendant au moins quatre ans (16). C’était avec ce type de traitement que l’on obtenait les meilleurs résultats mais des rechutes après plusieurs années de traitement étaient encore constatées (24). Cette inefficacité provient du fait que, parmi ces antibiotiques, aucun n'est doué de propriétés bactéricides vis-à-vis de Coxiella burnetii (38, 110). On aurait, en fait, une perte de l’activité bactéricide, due à l’environnement acide des phagolysosomes (24, 38).

Ainsi, en utilisant un agent alcalinisant lysosomotrope tel que l’hydroxychloroquine, on restaure les propriétés bactéricides de la doxycycline (24, 38). En effet, lorsque l’on maintient une concentration plasmatique égale à 1 mg/L, le pH dans les phagolysosomes passe de 4,8 à 5,7 (106). Le protocole de traitement recommandé à ce jour est le suivant (103) :

doxycycline, 200 mg par jour en deux prises. hydroxychloroquine, 600 mg par jour en trois prises. La posologie de

l’hydroxychloroquine est à adapter en fonction des taux plasmatiques, qui doivent être compris entre 0,8 et 1,2 mg/L, et de la tolérance du patient. Elle est en général adaptée à 400 mg par jour en deux prises après trois à six mois, puis 200 à 300 mg par jour après six mois. Ce traitement doit être poursuivi pendant au moins 18 mois. On réalise également un suivi du titre en anticorps anti-phase I par immunofluorescence indirecte à un rythme de six dosages par an (24).

Le risque majeur de ce traitement est la photosensibilisation, ce qui contre-indique absolument toute exposition solaire. De plus, le risque d’accumulation rétinienne de l’hydroxychloroquine nécessite une surveillance ophtalmologique tous les six mois (83).

Le traitement peut être arrêté lorsque le titre d’Ig G de phase I passe sous le seuil de 1 : 800 et que celui des Ig M et Ig A de phase I passe sous le seuil de 1 : 50 (en immunofluorescence indirecte) (24).

Le traitement médical est parfois complété par un traitement chirurgical (de remplacement valvulaire), l’indication étant posée en fonction de l’état hémodynamique du patient (24). La valve réséquée doit être adressée à un laboratoire capable de détecter la présence de Coxiella burnetii par immunohistochimie, culture ou amplification génomique. Un résultat négatif permet en effet d’arrêter le traitement. Toutefois, un suivi régulier est nécessaire pendant de nombreuses années, en raison de rechutes précoces et tardives (83).

2.4.2.5.3. Forme aiguë chez des patients porteurs d’une lésion valvulaire

Les patients porteurs d’une lésion valvulaire et développant une forme aiguë de fièvre Q devraient être traités pendant une durée plus longue dans la mesure où le risque de développer une endocardite est estimé, dans cette population, à 40% (24, 103) voire 75% chez le patients non traités (41). Le protocole recommandé est similaire à celui conseillé pour le traitement des formes chroniques :

doxycycline, 200 mg par jour en deux prises. hydroxychloroquine, 600 mg par jour en trois prises. La posologie de

l’hydroxychloroquine est à adapter en fonction des taux plasmatiques, qui doivent être compris entre 0,8 et 1,2mg/L, et de la tolérance du patient. Elle est en général

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adaptée à 400 mg par jour en deux prises après trois à six mois, puis 200 à 300 mg par jour après six mois. Cette association est administrée pendant une période de 12 mois. Un suivi, tous les trois mois pendant au moins deux ans (41), des titres en Ig G et Ig A anti-Coxiella burnetii phase I est réalisé de façon à objectiver l’absence d’une éventuelle évolution vers l’endocardite. Les seuils critiques sont de 1 : 800 pour les Ig G et de 1 : 50 pour les Ig A, en immunofluorescence indirecte.

2.4.2.5.4. Fièvre Q contractée en cours de grossesse

Durant la grossesse, la doxycycline et les quinolones sont contre-indiquées mais l’on peut utiliser la rifampicine et le cotrimoxazole. Cette dernière molécule, administrée tout au long de la grossesse, semble être efficace pour prévenir les risques d’avortement et de mortalité néonatale. Cependant, elle ne réduit pas les risques de survenue d’une forme chronique chez la mère (106).

Un autre protocole de traitement faisant appel à l’association sulfaméthoxazole/triméthoprime, à la dose, respectivement, de 800 mg et 25 mg par jour, peut être proposé. Ce traitement, prescrit pendant toute la grossesse, permet d’éviter la mort du fœtus et l’infection néo-natale, et ce, même s’il n’est pas bactéricide. La tolérance du traitement doit être évaluée tous les 15 jours par un suivi hématologique afin de vérifier l’absence d’anémie macrocytaire et d’y pallier, au besoin, par administration d’acide folinique (104).

Après l’accouchement, un examen sérologique est réalisé afin de dépister les profils sérologiques d’infection chronique. Dans ce cas, la patiente est traitée comme pour une fièvre Q chronique, de manière à prévenir l’apparition d’une endocardite et la survenue d’avortements lors des grossesses ultérieures (104).

Le traitement repose sur l’utilisation d’antibiotiques capables de pénétrer dans les tissus, de se concentrer dans les phagolysosomes et d’être actifs à un pH inférieur à cinq. - forme aiguë : doxycycline, 100 mg deux fois par jour pendant 15 à 21 jours. - forme chronique : doxycycline, 100 mg deux fois par jour pendant 18 mois, associée à l’hydroxychloroquine, 200 mg trois fois par jour pendant six mois puis 200 à 300 mg par jour pendant 12 mois. Ce traitement nécessite un suivi régulier, les effets secondaires majeurs étant la photosensibilisation et l’accumulation rétinienne d’hydroxychloroquine.

- forme aiguë chez un patient valvulopathe : doxycycline, 100 mg deux fois par jour pendant 12 mois, associée à l’hydroxychloroquine, 200 mg trois fois par jour pendant six mois puis 200 à 300 mg par jour pendant six mois. On effectue le même type de suivi que dans le cadre de la forme chronique.

- fièvre Q contractée en cours de grossesse : sulfaméthoxazole, 800 mg par jour et triméthoprime, 25 mg par jour pendant la durée de la grossesse. Le traitement nécessite un suivi hématologique et sérologique.

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2.5. Méthodes de prévention 2.5.1. Chez l’animal

La lutte contre l’infection animale se heurte à la complexité de l’épidémiologie : une

multiplicité de réservoirs et de vecteurs, une infection le plus souvent inapparente, une grande résistance de la bactérie sous forme desséchée et sa dissémination sous forme d’aérosols infectieux. Dans ce contexte une prophylaxie d’éradication semble difficilement envisageable (117).

Ainsi, la prophylaxie de la fièvre Q animale comporte deux objectifs majeurs : lutter contre la maladie animale proprement dite en limitant ses conséquences au point de vue clinique et économique mais surtout lutter contre la fièvre Q zoonose en limitant l’excrétion et la dissémination de l’agent pathogène (36).

2.5.1.1. Prophylaxie sanitaire - en milieu sain :

Les mesures de prophylaxie sont, dans ce contexte, de nature protectrices. éviter l’introduction d’animaux de statut sanitaire inconnu (96, 112), notamment

avant la saillie ou pendant la gestation, périodes où les animaux sont les plus réceptifs (34).

préférer l’insémination artificielle à la monte naturelle (34). contrôler le statut sanitaire des animaux à l’achat : mise en quarantaine, contrôle

sérologique (et/ou recherche de Coxiella burnetii dans les produits de la parturition) de l’animal et du troupeau d’origine (96, 116, 117, 127).

tester les primipares pendant la deuxième moitié de la gestation (ce sont elles qui expriment les taux d’anticorps les plus élevés), de manière à vérifier le statut du troupeau (34).

utiliser des insecticides de contact pour éviter l’éventuel cycle par les tiques (30, 116). limiter le contact de l’élevage avec les réservoirs sauvages et domestiques : clôture

des pâturages, limitation de la transhumance, … (34, 117, 127). - en milieu infecté :

Les mesures, que l’on ajoute aux mesures appliquées dans une exploitation indemne, visent à limiter la contagion et la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Elles doivent être très sévères en zone contaminée (30).

placer les animaux infectés en box isolés lors de la mise bas (30, 116, 117). Les parturientes et leurs produits doivent rester isolés pendant deux semaines (34).

détruire les placentas et les avortons, avec précautions et de façon précoce (30, 75, 116, 117, 134).

isoler les femelles en chaleur, inséminées ou non (30). traiter les femelles gestantes aux tétracyclines dans les semaines précédant la mise bas

(117). surélever les lieux d’alimentation de manière à ce que l’urine et les fécès ne

contaminent pas les aliments (34). traiter les animaux contre les ectoparasitoses (30, 116). maintenir les animaux loin des villes, interdire les déplacements (transhumance,

foires, …) (38, 116, 127).

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effectuer des tests sérologiques, appariés et systématiques, lors de métrite ou d’avortement (30).

abattre les animaux avec des précautions spéciales (30). veiller à la propreté du personnel et à la désinfection des vêtements, à l’eau de Javel,

au formol ou à l’alcool iodé (30, 115, 116). Le personnel doit porter un masque et des gants (34, 75).

désinfecter et désinsectiser les locaux (75, 134). La paille contaminée doit être détruite (34, 134).

désinfecter les véhicules et le matériel (134). contrôler les carnivores domestiques (116). réaliser des sondages épidémiologiques tri ou quadriennaux afin d’avoir une idée du

statut sanitaire de l’élevage (36). déclarer les cas de fièvre Q clinique animale à la Direction Départementale des

Services Vétérinaires (DDSV) (36).

- mesures concernant les denrées d’origine animale :

A l’abattoir, certaines règles d’hygiène sont à respecter : transport des animaux en véhicule étanche (34). abattage dans des locaux isolés de la chaîne d’abattage (34, 88). mouillage du cuir jusqu’au salage (112). saisie des organes contaminants : mamelle, poumon, rate,… (34, 112). désinfection et désinsectisation terminales (34, 88).

Cependant, les animaux infectés ne sont pas marqués : ces mesures restent donc difficiles à appliquer.

En ce qui concerne la vente de lait cru ou de produits à base de lait cru, il existe des dispositions réglementaires. L’arrêté ministériel du 6 août 1985, réglemente la vente directe et stipule que pour être reconnu propre à la consommation humaine, le lait cru, livré en l’état doit provenir d’étables n’ayant eu aucun cas de fièvre Q depuis au moins un an (32). Cet arrêté a été complété par l’arrêté ministériel du 18 mars 1994, modifié par les arrêtés du 2 mars 1995, du 25 septembre 1995 et du 10 février 1997. Il précise que le lait cru doit provenir d’animaux ne présentant aucun symptôme de maladie contagieuse transmissible à l’Homme par le lait et dont l’état de santé général ne présente aucun trouble apparent, et plus particulièrement en ce qui concerne les maladies génitales accompagnées d’écoulements, les entérites avec diarrhée accompagnée de fièvre ou les inflammations visibles du pis (32). Enfin, une note de la Direction Générale de l’Alimentation (DGAL) du 10 février 1997 (Note DGAL/SDHA/N97/N°8019) indique aux fabricants de fromages au lait cru la conduite à tenir en cas de fièvre Q : ils ne doivent pas utiliser le lait des animaux ayant avorté, et le lait des autres animaux de l’exploitation ne peut être utilisé qu’après un traitement de pasteurisation haute (85°C pendant 30 secondes) (8, 9, 34, 117).

71

2.5.1.2. Prophylaxie médicale

Les mesures sanitaires étant souvent insuffisantes, du fait de la multiplicité des sources de contamination, la prophylaxie médicale comporte un intérêt certain.

2.5.1.2.1. La vaccination

Les vaccins inactivés contre la fièvre Q sont produits à partir de la phase II, c’est- à dire à partir de Coxiella burnetii atténuées après plusieurs passages sur culture cellulaire ou sur œuf embryonné. Les bactéries en phase II pénètrent plus facilement dans les cellules que celles en phase I mais elles ne peuvent pas se multiplier dans les monocytes et les macrophages et ne résistent pas aux défenses de l’animal. Elles sont donc rapidement éliminées (113). La formation d’anticorps est donc faible et irrégulière et leur persistance est limitée (deux à six mois environ) (30). De plus, les anticorps contre le LPS en phase II protègent mal contre la phase I (113).

En pratique, le seul vaccin disponible actuellement en France (Chlamyvax-FQ® distribué par Mérial) est un vaccin inactivé, destiné aux ovins. Il associe Chlamydophila psittaci et Coxiella burnetii en phase II (38). Il permet de diminuer le nombre d’avortements mais n’empêche pas totalement ni le portage ni l’excrétion (8, 9, 110, 113, 115, 116, 117). Cependant, la vaccination pratiquée uniquement dans les cheptels contaminés reste intéressante du fait de la réduction des manifestations cliniques. De plus, il semble qu’elle interrompe (au moins en partie) le cycle de contagion, produisant ainsi « l’effet troupeau » (30). Le protocole utilisé chez les bovins est le suivant : dès le diagnostic, toutes les génisses de plus de six mois et les vaches vides ou gestantes de moins de trois mois sont vaccinées avec un rappel quatre à 12 mois après, selon le stade de gestation. Ensuite, une vaccination annuelle systématique est effectuée sur toutes les femelles après le part et avant l’insémination (30). Chez les ovins, la vaccination est préconisée un mois avant la lutte ou au deuxième mois de gestation (96).

Bien sûr, la contamination humaine est toujours possible malgré la vaccination. Une épidémie de fièvre Q a été ainsi rapportée en 1992 chez des personnes en contact avec des chèvres vaccinées (116). De plus, le vaccin de phase II est souvent utilisé par les éleveurs après un épisode abortif. Ils procèdent dans l’urgence et en aveugle à la vaccination de tout le troupeau : il est alors impossible de déterminer la part d’efficacité de la vaccination dans ces conditions (115).

La vaccination par un vaccin de phase I serait préférable car la protection obtenue est 100 à 300 fois meilleure que celle d’un vaccin de phase II (42, 115, 116, 117) mais l’innocuité n’est pas totale (83). Un tel vaccin n’est donc pas disponible en France, la Slovaquie est le seul pays à l’utiliser en médecine vétérinaire (113, 116). Par ailleurs, des essais ont été effectués sur des vaccins Chloroform Methanol Residu (CMR) préparés à partir du vaccin humain australien. Les premiers résultats semblent concluants tant en terme d’efficacité que d’innocuité (20, 34). L’excrétion est alors réduite de façon significative, même si quelques expériences ont montré que le vaccin de phase I n’empêche pas complètement l’excrétion chez les animaux infectés avant la vaccination. Certains auteurs préconisent donc de vacciner les jeunes animaux pendant plusieurs années (115, 116).

72

2.5.1.2.2. L’association vaccination-antibioprévention

L’association Terramycine Longue Action à raison de 10 g par animal, administrée trois semaines avant le part et d’un vaccin inactivé de phase II (Aborstop FQ® (mis au point par le laboratoire Roger Bellon)) a donné des résultats intéressants : 5,4% d’animaux positifs contre 35% dans le lot témoin, sur un total de 150 placentas examinés (36).

2.5.2. Chez l’Homme

2.5.2.1. Prophylaxie sanitaire Il s’agit de mesures d’hygiène générale et de bon sens :

port de masque et de gants en zone contaminée (75). isolement et désinfection du matériel infecté (134). pasteurisation du lait (85, 134). signalement des foyers de fièvre Q par les vétérinaires (36). information et contrôles sérologiques des personnes potentiellement exposées (éleveurs,

vétérinaires, personnel de laboratoire, …) ou présentant une symptomatologie suspecte (36, 75, 85, 112,).

information des personnes les plus vulnérables (femmes enceintes, personnes porteuses d’une valvulopathie, immunodéprimées, …) afin qu’elles évitent la consommation de lait cru, les zones géographiques à risques ainsi que tout contact avec les ruminants surtout en période de mise bas (38, 88, 105, 112).

recherche sérologique systématique sur les personnes présentant un syndrome grippal ou une pneumopathie atypique (36).

collaboration accrue entre les services vétérinaires et médicaux (117). augmentation du dépistage systématique des troupeaux infectés et amélioration du

diagnostic de l’infection animale (112, 117). contrôle des animaux domestiques (traitement contre les tiques, interdiction d’accès aux

bâtiments d’élevage, limitation de la prédation) (38, 40).

2.5.2.2. Prophylaxie médicale

Elle repose essentiellement sur la vaccination ; cependant, toute exposition inopinée à Coxiella burnetii doit faire l’objet d’une chimioprophylaxie par les tétracyclines pendant huit jours (105).

La vaccination consiste en l’injection d’antigènes de phase I. Deux vaccins ont été

étudiés : l’un développé en Australie (Q-Vax, Commonwealth Serum Laboratories) comportant la souche Henzerling, entière, inactivée au formol, entraînant chez l’Homme 50 à 80% de séroconversion et le développement d’une bonne immunité à médiation cellulaire (127). Il assure ainsi une protection efficace pendant au moins cinq ans. L’autre vaccin, utilisé en ex-Tchécoslovaquie, est composé de la fraction soluble de la souche Nine Mile extraite par l’acide trichloracétique et permet d’obtenir jusqu’à 74% de séroconversion (38, 105, 134). Cependant son efficacité clinique n’a pas été évaluée (38).

Les candidats à la vaccination sont en particulier les vétérinaires, les employés d’abattoirs, les éleveurs, les employés de laboratoires pratiquant l’isolement de Coxiella burnetii, et toutes les personnes exposées aux animaux infectés. Pour certains auteurs, il

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conviendrait également d'envisager l'opportunité d'une vaccination chez les personnes susceptibles d'être victimes des formes chroniques de fièvre Q (individus immunodéprimés, individus atteints de valvulopathie...) (38, 83) surtout dans les zones connues d’endémies (41). Cependant, les candidats à la vaccination doivent faire l’objet d’une vérification de leur sérologie et d’un test cutané réalisé avec une sous-unité de vaccin. En effet, le vaccin déclenche chez les patients déjà immunisés, par une vaccination préalable ou par une infection naturelle, des réactions cutanées locales sévères (38, 105). Il s’agit d’abcès sous-cutanés, stériles, qui peuvent, dans certains cas, se compliquer par une fistule et nécessiter un drainage chirurgical (80, 110).

Afin de limiter ces effets, un vaccin Chloroform Methanol Residu (CMR) a été récemment proposé pour la vaccination humaine (83).

La réponse post-vaccinale peut être évaluée par la mesure du titre anticorps et par intradermoréaction : ce dernier test est même un meilleur indicateur pour évaluer le degré de protection contre la fièvre Q puisqu’il atteste de l’intensité de la réponse à médiation cellulaire (83).

La prophylaxie chez l’animal comporte deux objectifs : réduire les conséquences cliniques et économiques, et lutter contre la fièvre Q zoonose en limitant l’excrétion de Coxiella burnetii. - les mesures sanitaires : ¤ en milieu sain : ce sont des mesures protectrices visant à éviter l’introduction de l’agent dans le troupeau (tests lors de l’introduction d’un nouvel animal, limitation des contacts avec la faune sauvage, traitements insecticides, ...). ¤ en milieu infecté : on rajoute aux précédentes des mesures visant à limiter la dissémination de l’agent (mise bas en box isolé, destruction des produits de la mise bas, limitation des déplacements d’animaux, désinfection des locaux et du matériel, etc). ¤ concernant les denrées alimentaires d’origine animale : on a des règles d’hygiène à l’abattoir (mouillage des cuirs, saisies des organes contaminants, etc.) ainsi que des dispositions réglementaires en matière de vente de produits à base de lait cru. - les mesures médicales : seul un vaccin inactivé de phase II est actuellement disponible. Il permet de réduire le taux d’avortement mais n’a pas d’activité sur le portage ou l’excrétion. Un vaccin de phase I, 100 à 300 fois plus efficace, est actuellement à l’étude. L’association entre la terramycine longue action ( 10 g par animal, trois semaines avant le part) et la vaccination donne, par ailleurs, des résultats intéressants.

La prophylaxie chez l’Homme comporte également un volet sanitaire et un volet médical : - les mesures sanitaires se résument à des mesures de bon sens et d’hygiène (port d’un masque en zone infectée, désinfection des locaux et du matériel, pasteurisation du lait, information des populations et notamment des catégories de personnes à risques).

- les mesures médicales reposent sur la chimioprévention aux tétracyclines pendant huit jours, chez les personnes ayant été exposées et sur la vaccination (vaccin inactivé de phase I) des professions à risques. Ce vaccin, utilisé en Australie, n’est pas encore commercialisé en France.

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3. La fièvre Q et le risque biologique provoqué intentionnel 3.1. La guerre biologique : quelle menace ?

3.1.1. Historique

L’usage des armes biologiques remonte à la plus haute Antiquité. Il fut, pendant deux millénaires environ, purement empirique jusqu’à ce que la bactériologie naissante permette à la guerre biologique de s’appuyer sur une connaissance scientifique des agents infectieux, bactéries et virus : tous les fruits d’une recherche humanitaire pacifique et bienfaisante allaient être détournés pour devenir moyen de destruction. Les conflits des Temps Modernes donnèrent une impulsion considérable à la recherche en matière de guerre biologique et les modalités de son utilisation (89).

3.1.1.1. Première période : de l’Antiquité à Pasteur

Des siècles avant la connaissance des bactéries et des virus, les Hommes avaient pu établir certaines relations de cause à effet, observer certains phénomènes pathologiques qu’ils ne savaient pas encore interpréter mais qu’ils tentèrent, empiriquement, de reproduire à des fins meurtrières. Une étude sur les ruses de guerre dans l’Antiquité a rapporté comment les archers scythes infectaient leurs flèches en les trempant dans des cadavres en décomposition, dans du sang putréfié ou dans du fumier, générateur de tétanos ou de gangrène. Cette même étude a aussi montré que si certains stratèges se préoccupaient de choisir des emplacements sains pour faire camper leurs troupes, d’autres surent imposer à l’ennemi des séjours prolongés en terrain insalubre : ainsi, en 414 avant Jésus Christ, lors du siège de Syracuse, Hermocrates sut amener les troupes athéniennes à séjourner dans une plaine marécageuse bien connue des autochtones pour son endémie palustre. La malaria régla le sort de l’armée athénienne. Le même stratagème fut répété vers 350 avant Jésus Christ par Clearchos, au siège d’Astacos.

A cette idée d’amener l’ennemi en zone réputée malsaine succéda l’idée d’infecter délibérément les eaux, les aliments ou les lieux de cantonnement. A ce titre, on peut tenir comme véritables précurseurs de la guerre bactériologique les Vazimbas qui auraient élevés des tiques vectrices de fièvre récurrente, pour rendre leurs habitations dangereuses pour leurs ennemis, les Sakalaves.

Polluer les eaux des citernes ou des puits en y jetant des cadavres ou immondices fut sans doute une pratique ancienne ; mais la première tentative connue pour répandre une maladie présumée contagieuse en infectant des aliments avec des produits pathologiques serait due aux Espagnols qui, durant la campagne de Naples en 1495 auraient abandonné aux Français du vin additionné de sang prélevé chez des lépreux.

C’est à l’emploi délibéré de la peste que l’Europe serait redevable des quinze à vingt millions de victimes qui succombèrent de 1348 à 1350 au début de la seconde pandémie pesteuse : les Génois occupaient sur la côte orientale de Crimée le comptoir de Caffa où aboutissaient les caravanes venant de l’Orient. En 1344, les Mongols assiégèrent la ville et durant trois ans ne purent y pénétrer. Ils se disposaient à lever le siège lorsque la peste, banale en Asie centrale, frappa les assaillants. Leur chef, Djanisberg, fit alors catapulter par dessus les murailles les cadavres de ses soldats. Espérait-il déclencher une épidémie ? Quoiqu’il en soit, celle-ci éclata et les Génois, qui finirent par s’embarquer, disséminèrent la peste en Méditerranée. Ainsi naquit la grande peste du Moyen Age.

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Le procédé fit école : ainsi, en 1422, au siège de Carolstein, Corbut fit jeter dans la ville les corps de ses soldats morts de peste. En 1710 en Estonie, au siège de Reval, l’armée russe recourut, elle aussi, à la projection de cadavres et de pestiférés. En 1725, au siège de La Calle, en Tunisie, les Nadis jetèrent par dessus les murailles des lambeaux de vêtements de pestiférés.

Ces diverses tentatives correspondaient à l’exploitation de la survenue fortuite d’une maladie infectieuse. Mais en 1650, Siemenowicz, lieutenant général de l’artillerie polonaise, proposa de préparer systématiquement des projectiles infectants. Ils ne furent pas préparés mais, pour la première fois, le concept fondamental de déclenchement d’une épidémie était clairement énoncé. Il devait influer sur le choix des maladies à utiliser et la variole, du fait de sa grande contagiosité, se prêtait plus que les autres à la création d’épidémies massives. Si, pour certains, la variole aurait été introduite involontairement dans le Nouveau Monde, d’autres accusent Pizarre d’avoir délibérément fait distribuer aux Indiens des vêtements de varioleux. Le même procédé fut utilisé à Fort-Pontiac en 1763 contre les Indiens d’Amérique du Nord : le général Amhertz, gouverneur de la Nouvelle-Ecosse, suggéra au colonel Bouquet de répandre la petite vérole parmi les tribus indiennes grâce à des couvertures infectées. Un siècle plus tard, durant le siège de Paris, un médecin proposera « de prendre au Val-de-Grâce, 7 à 8 000 couvertures ayant servi à des variolés, de les emporter dans une voiture et de les abandonner en se retirant ; ainsi les Prussiens s’en serviraient et attraperaient la petite vérole » (89).

3.1.1.2. Deuxième période : l’ère pasteurienne

Après des siècles d’empirisme, la connaissance scientifique des agents infectieux et de l’épidémiologie des maladies infectieuses allait fournir ses bases modernes à l’arme biologique.

Assez paradoxalement, c’est à Pasteur qu’est due l’idée d’utiliser une espèce microbienne vivante pour détruire d’autres espèces. En 1887, ayant lu dans Le Temps que le gouvernement australien cherchait à détruire les lapins qui dévastaient les Nouvelles Galles du Sud, Pasteur lui répondit, en proposant de déclencher une épizootie chez ces animaux : « on a employé jusqu’à présent des substances minérales, notamment des combinaisons de phosphorés. Pour détruire des êtres qui se propagent selon des lois d’une progression de vie effrayante, que peuvent de tels poisons minéraux ? Ceux-ci tuent sur place là où on les dépose ; mais en vérité, pour atteindre des êtres vivants, ne faut-il pas plutôt un poison comme eux doué de vie, et comme eux, pouvant se multiplier avec une surprenante fécondité ? Je voudrais donc que l’on cherchât à porter la mort dans les terriers en essayant de communiquer aux lapins une maladie pouvant devenir épidémique. Il est facile de cultiver le microbe dans des bouillons de viande. De ces liquides pleins de microbes, on arroserait la nourriture des lapins qui, bientôt, iraient périr ici et là et répandre le mal partout ».

Cette lutte biologique contre les lapins fut utilisée avec succès dans la région de Reims avant d’être appliquée contre les spermophiles en Bessarabie, les campagnols en Allemagne et divers rongeurs en France. De la lutte biologique contre les animaux nuisibles à la guerre biologique, il n’y avait qu’un pas ; il fut franchi lors de la première guerre mondiale (89).

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3.1.1.3. 1914-1918 : la première guerre mondiale et les premières tentatives d’utilisation militaire

Y eut-il réellement utilisation ou seulement constitution de stocks infectieux ? Il est

difficile de le dire, compte tenu du climat de défiance qui fit attribuer à une intervention de l’ennemi tout épisode pathologique : ainsi, en 1916, la survenue de charbon parmi les troupeaux de bovins importés d’Argentine fit incriminer des saboteurs allemands.

En revanche, la constitution de stocks de bactéries pathogènes ne fait pas de doute : en 1916, des lots de culture de bacilles de la morve furent saisis à la légation allemande de Bucarest avec des notices : « chaque ampoule suffit pour 200 têtes. Autant que possible, inoculer directement dans la gueule, sinon mêler au fourrage ».

Plusieurs notes du Grand Quartier Général datées de 1917 et 1918 ont fait état de découvertes de tentatives de dispersion de la morve et du choléra en plusieurs points du front après le recul des armées allemandes.

Mais dans l’ensemble, l’arme biologique ne fut pas encore appliquée sur une grande échelle et restait considérée essentiellement comme une arme de sabotage destinée à retarder l’avancée de l’ennemi ou à le démoraliser (89).

3.1.1.4. Quatrième période : aux alentours de la seconde guerre mondiale

A partir de 1930, l’arme biologique s’orienta vers des applications stratégiques : destruction de populations, neutralisation de moyens de défense sur le territoire adverse.

Dans plusieurs pays fut entreprise une expérimentation visant à choisir les « meilleurs » agents pathogènes, les produire en masse, les stocker, et mettre au point des procédés de dispersion sur de très larges étendues. De 1931 à 1945, l’armée japonaise expérimenta en Mandchourie, dans trois centres spécialisés dont le plus atroce fut « l’Unité 731 » du Général Ishii, la peste , le charbon, la morve, la fièvre typhoïde, la dysenterie et le choléra. Des milliers de prisonniers chinois, coréens, russes et américains furent inoculés dans des conditions dépassant celles des camps nazis. Parallèlement, des insectes vecteurs étaient élevés puis contaminés et des dispositifs d’épandage étaient expérimentés : bombes à fragmentation, bombes en porcelaine, aérosols, etc. Il semble établi que, de 1940 à 1944, l’aviation japonaise a répandu la peste en Chine dans 11 villes des sept districts ; la technique était variable selon les localités : aérosols, largage de bombes, dispersion de puces infectées et de riz destiné à attirer les rongeurs locaux. Evacuée en 1945, l’existence de « l’Unité 731 » fut révélée en 1949 au procès de Khabarovsk où ne furent jugés qu’une douzaine de personnes alors que le Général Ishii sut négocier avec l’armée américaine les conditions de sa libération (89).

En Grande Bretagne, le British Biological Warfare Project remonte à 1934. En 1936, fut créé un corps d’experts pour étudier la portée de la guerre bactériologique et en 1940, sous l’impulsion de Churchill fut créé le laboratoire secret de Porton-Down qui travailla en liaison étroite avec l’armée américaine. Les recherches comportèrent deux thèmes dominants : Bacillus anthracis et Clostridium botulinum. Les modalités de dispersion furent soigneusement mises au point et l’on connaît maintenant les détails de l’expérimentation de la « bombe à anthrax » réalisée au large de l’Ecosse sur un troupeau de moutons, dans l’île de Gruinard durant l’été 1942 : les moutons ont commencé à mourir trois jours plus tard et 90% des animaux périrent. Les spores, comme c’était prévisible, ont persisté durant des décennies et la décontamination de l’île a été entreprise en 1986. Elle a nécessité 280 tonnes de formaldéhyde.

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En 1990, un troupeau de moutons a été réintroduit dans l’île, les animaux n’ont pas développé de symptôme. Cependant, les scientifiques estiment que le sous-sol de l’île serait contaminé pour plus de 100 ans (89, 93).

En ce qui concerne le botulisme, de nombreuses expériences furent également conduites ; la plus spectaculaire ayant été l’assassinat d’Heydrich en 1942 à l’aide d’une grenade antichar sur laquelle étaient fixées des ampoules de toxine botulique (89).

En 1941, l’URSS avait déjà un programme avancé de recherche sur les armes biologiques. En 1942, lors de la bataille de Stalingrad, l’armée allemande a été contaminée par la tularémie, ainsi que les soldats russes et la population locale. On a recensé plus de 100 000 cas avec 70% de malades contaminés par voie respiratoire. En 1943, les sites de recherche et d’essai ont été déplacés à Kirov et à l’île du Renouveau dans la mer d’Aral et, en 1946, un institut militaire de recherche bactériologique a été ouvert à Sverdlovsk (93).

Aux Etats-Unis, le programme de recherche débuta en 1942 piloté par le War Reserve Service dans une unité de recherche et de développement à Camp Detrick dans le Maryland, avec un site de test dans le Mississippi puis dans l’Utah et une unité de production à Terre Haute dans l’Indiana. Camp Detrick employait 3 800 militaires en 1943. Les recherches étaient concentrées sur la fièvre charbonneuse, le botulisme, la brucellose, la psittacose, la tularémie et la morve. Des tests sur Bacillus anthracis et Brucella suis ont été effectués et les chercheurs ont produit 5 000 bombes (93).

En 1945, l’Allemagne, au centre de Posen, a fait des recherches sur la peste, le choléra et la fièvre jaune, et a contaminé un réservoir d’eau en Bohême (93).

3.1.1.5. Cinquième période : de l’après guerre à aujourd’hui

3.1.1.5.1. Aux Etats-Unis

Après la seconde guerre mondiale, la production d’armes biologiques est officiellement stoppée, mais la recherche continue. En 1948, le rapport Baldwin montre la vulnérabilité du pays dans ce domaine et conseille de développer les moyens de détection et d’identification, les moyens de décontamination, de protection, de prophylaxie et de traitement ; ainsi que les moyens de dissémination.

En 1950, les Etats-Unis ont travaillé sur la conception de bombes microbiologiques à retardement. Ils travaillaient notamment sur la fièvre charbonneuse. Bill Patrick conduisait ces recherches. Les chercheurs ont effectué des essais sur des militaires et des prisonniers du pénitencier de l’Ohio. Des essais ont été réalisés également sur la population américaine avec des souches inoffensives telles que Bacillus globigii et Serratia marcescens qui ont été dispersées dans la baie de San Francisco par la marine américaine ; la plupart des habitants de la ville auraient ainsi inhalé au moins 5 000 particules contaminées et 11 personnes infectées par Serratia marcescens ont développé des symptômes (31, 93). En 1951, une souche non pathogène de Coccidioïdes immitis a été testée sur une population noire dans des dépôts d’approvisionnements militaires en Pennsylvanie, à Norfolk et en Virginie (93).

En 1951, pendant la guerre de Corée (1950-1953), la Corée du Nord et la Chine ont accusé les Américains d’avoir effectué des attaques bactériennes. Les Etats-Unis auraient répandu des insectes qui auraient propagé la peste et le choléra, en Corée et dans la partie Nord-Est de la Chine (89, 93). D’après Frailé Ricardo, l’URSS a affirmé que les Américains bombardaient les positions ennemies avec des obus, des « bombes à plume », servant à la distribution de tracts de propagande, contenant des charges bactériologiques. Lors des

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explosions, une fumée aurait libéré « des mouches porteuses de microbes, des puces ou des araignées ou des oiseaux ». Une commission scientifique internationale a fait une enquête et a découvert une épidémie de peste dans les régions mentionnées dans les plaintes. La peste avait disparu de Corée depuis 1912 et le choléra depuis 1946. Les experts de la commission ont trouvé des insectes et d’autres animaux n’appartenant pas à la faune locale. Les insectes étaient porteurs de Bacillus anthracis et des campagnols étaient infectés par Yersinia pestis. Les méthodes de dissémination correspondaient à celles employées par les Japonais pendant la seconde guerre mondiale. Sachant que les Etats-Unis ont récupéré le programme japonais et le Général Ishii après l’Armistice, l’hypothèse qu’ils aient employé les mêmes méthodes est plausible. De plus, d’après Endicott et Hagerman, une épidémie d’encéphalite toxique aiguë s’est déclarée dans trois villes de la province de Liaoning en Chine, à la frontière coréenne. Cette encéphalite différait de celle rencontrée dans ce secteur et l’infection n’était pas propagée par des piqûres de tiques mais par voie digestive ou respiratoire. D’après Mao, ces attaques biologiques n’auraient pas été très efficaces : quelques centaines de morts chez les militaires et 2 000 parmi les civils.

Il est difficile de faire la part des choses : on sait que les Etats-Unis ont fait des recherches sur les insectes et sur les moyens de dissémination avec ces vecteurs ; selon Frailé, ils ont même augmenté leurs crédits pour ces recherches en 1953 et la presse américaine relatait aussi, à cette époque, l’existence d’armes secrètes. Mais, d’après les experts, les maladies n’ont pas pu être transmises par les insectes décrits dans le rapport de la Commission d’enquête. De plus, les photos des insectes, des bombes et des bactéries publiées dans le Quotidien du Peuple en mars 1952 auraient été falsifiées. Les aviateurs américains détenus par la Corée du Nord et la Chine ont reconnu les faits puis se sont rétractés de retour dans leur pays. Il n’y a pas de preuve concrète de la culpabilité des Etats-Unis. Lors des pourparlers de paix à la fin du conflit, aucune accusation n’a été mise en avant par la Corée du Nord et la Chine, sans doute pour éviter des inspections sur leurs territoires. Cependant, les auteurs s’accordent à considérer que les Etats-Unis ont bien fait des expérimentations lors de la guerre de Corée.

En 1955, les essais américains portaient sur l’agent de la fièvre Q. Les militaires ont équipé un chasseur à réaction d’un diffuseur de bactéries. Lors de l’essai, ils ont constaté que la dissémination avait été efficace sur une étendue de 80 kilomètres. En 1956, la production d’agents microbiologiques s’est faite à grande échelle sur le site de Pine Bluff, en Arkansas. 45 litres de Coxiella burnetii et 200 litres de virus de l’encéphalite équine du Venezuela ont été produits chaque semaine. En 1956, pendant la crise avec Cuba, les Etats-Unis ont eu l’intention de recourir à une attaque microbiologique. Ils envisageaient de disperser, avant l’arrivée des troupes américaines à Cuba, un mélange d’entérotoxine B staphylococcique, de virus de l’encéphalite équine du Venezuela et de Coxiella burnetii. Ils ont aussi envisagé d’utiliser la variole pendant la guerre du Vietnam.

En 1965, une étude a montré que les deux tiers des Etats-Unis avaient été atteints par un essai de dispersion de particules simulant le virus de la variole, réalisé par l’US Army de Fort Detrick dans l’aéroport de Washington et dans le terminus des autocars Greyhound. En 1966, Bacillus subtilis a été dispersé dans le métro de New York par l’intermédiaire des systèmes d’aération : les extrémités des lignes ont été atteintes en quelques minutes sous l’effet des turbulences des rames. On estime, par extrapolation, que la même attaque avec Bacillus anthracis aurait entraîné 12 000 cas d’infections mortelles (31, 89, 93).

En 1969, Nixon a annoncé que les Etats-Unis renonçaient aux armes microbiologiques. En 1971, Cuba a accusé la CIA d’avoir introduit la dengue et la peste porcine.

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En 1975, une enquête est menée par le Congrès Américain et montre que la CIA aurait conservé des souches d’agents de la fièvre charbonneuse, de la tularémie, de l’encéphalite équine du Venezuela, de la brucellose, de la variole, de la salmonellose ainsi que des toxines botuliques (93).

3.1.1.5.2. Biopreparat

En 1953, Krouchtchev était au pouvoir et, selon Ken Alibek (2), la 15ème Direction de

l’Armée Rouge, branche du ministère de la Défense, prenait en charge le programme de guerre biologique sous les ordres du colonel Smirnov.

En 1956, le maréchal Gueorgui Joukov, ministre de la Défense, annonce que l’URSS est prête à utiliser les armes chimiques et bactériologiques lors d’un conflit. Le programme biologique militaire était aussi coordonné par des organismes du ministère de l’Agriculture, de la Santé, le KGB et l’Académie des Sciences (93).

En 1973, l’agence Biopreparat fut crée par un décret de Brejnev. Officiellement, il s’agissait d’une firme pharmaceutique civile qui faisait de la recherche, participait aux conférences internationales, obtenait des souches d’agents pathogènes dans les banques mondiales. Par contre, officieusement, elle participait au programme militaire sur les agents pathogènes. Puis, le programme soviétique s’est intensifié : le « projet enzyme » fut lancé, il se consacrait à la tularémie, la fièvre charbonneuse, la morve, la variole, les virus de Marbourg, Ebola, Machupo, Junin, de l’encéphalite équine du Venezuela (93).

En 1975, Biopreparat fut soumis au plan quinquennal. En 1979, Iouri Tikhonovitch Kalinine en prenait la direction (2). Biopreparat employa des dizaines de milliers de personnes dont 9 000 scientifiques et comprenait 47 installations : 18 instituts de recherche, 6 unités de production et des sites de stockage (93).

Pour citer quelques exemples : les usines d’armement bactériologique à Sverdlovsk, Kirov et Zagorsk, l’institut de Biopréparation Ultra-pure de Leningrad qui fit des recherches dans les techniques de culture.

En 1980, à Omutninsk, l’entreprise que dirigeait Ken Alibek fit des recherches sur la tularémie, sur la production d’agents pathogènes et leur adaptation à l’armement ; à Obolensk, on s’occupait de l’ingénierie génétique et à l’institut d’immunologie de Lioubitchani à Tchekhov, on étudiait les souches résistantes aux antibiotiques. La virologie était exploitée dans le complexe de Vector près de Novosibirsk.

L’île du Renouveau ou de Vozrojdiéné dans la mer d’Aral, appelée Aralsk-7 était un centre d’essai à ciel ouvert des diverses armes produites. Ces essais étaient réalisés sur des animaux, voire sur des condamnés à mort ; de 1970 à 1990, ce centre a employé 10 000 personnes. Ces essais ont été la cause de contaminations de la population locale. En 1972, l’équipage d’un bateau de pêche a été retrouvé mort de la peste. La faune sauvage fut aussi victime d’épizooties suspectes et les hommes contractaient à un taux inhabituel des maladies mortelles et des cancers. Les essais cessèrent en 1992.

En avril 1979, dans une usine de production d’armes bactériologiques de Sverdlovsk, un accident se produisit une nuit dans l’enceinte n°19 et entraîna une épidémie de fièvre charbonneuse (2, 89, 93). Ken Alibek relate qu’un technicien avait démonté un filtre d’un tuyau d’évacuation vers l’extérieur, à la fin de son service, sans le remplacer. Au changement d’équipe, le système d’évacuation fut remis en route sans filtre et des spores de Bacillus anthracis s’échappèrent vers l’extérieur pendant plusieurs heures. L’équipe de nuit de l’usine de céramique en face de l’enceinte n°19 tomba malade deux à trois jours plus tard, de même que certains ouvriers des usines alentours.

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On a recensé officiellement 96 personnes contaminées et 66 morts. Officieusement, il y aurait eu 105 morts. A cette époque, l’enquête officielle avait conclu à une épidémie due à une cargaison de viande contaminée. Les activités du site ont été transférées en 1980 à Stepnogorsk mais il faudra attendre 1992 pour que le président Boris Eltsine reconnaisse les faits.

Ken Alibek a révélé qu’en 1988, lorsqu’il travaillait à créer une variété d’agent de la fièvre charbonneuse plus concentrée à Stepnogorsk, l’Etat major lui avait demandé de produire suffisamment de ces agents pour équiper des missiles géants SS-18. Ces missiles portent dix ogives de 500 kilotonnes chacune et ont une portée de 10 000 kilomètres. Pour dix ogives, il faut 400 kilogrammes d’agents secs. Un fermenteur de 20 tonnes, avec additif, peut produire 500 à 600 kilogrammes de spores de Bacillus anthracis en un à deux jours, soit un peu plus d’un missile. Donc, en dix à 14 jours, l’URSS était prête à armer une batterie de missiles pour une action bactériologique. Un seul de ces missiles pourrait tuer, théoriquement, la population de New York.

En 1992, Boris Eltsine a interdit la recherche biologique militaire offensive. En accord avec les Etats-Unis et la Grande Bretagne, les sites ont dû se reconvertir vers des activités pacifiques. Des stocks de Bacillus anthracis ont été enterrés sur l’île de la Renaissance. Ce site, ainsi que l’usine de Stepnogorsk ont été abandonnés (2, 93).

3.1.1.5.3. Les autres pays

En 1995, un rapport de l’Office of Technology Assesment (OTA, l’Office d’Evaluation Technologique Américain, un organisme de Congrès Américain) répertoriait 17 pays soupçonnés de posséder des armes biologiques. Un rapport d’information sur la prolifération des armes de destruction massive et leur vecteur présenté par Pierre Lellouche à l’Assemblée Nationale signalait les pays soupçonnés d’effectuer des recherches dans le domaine des armes biologiques. En 1999, on les estimait à 19 dont 13 seraient actifs : Algérie, Chine, Egypte, Inde, Iran, Irak, Israël, Libye, Corée du Nord, Russie, Syrie, Taiwan, Etats-Unis.

L’Inde et les Etats-Unis développent actuellement un programme défensif. Les pays du Moyen Orient comme l’Egypte, l’Irak, la Syrie ainsi que la Corée du Nord sont soupçonnés de posséder des programmes offensifs. La Russie poursuivrait actuellement un programme défensif, mais des doutes persistent sur la réalité de ces activités. La Chine n’a pas de programme connu, mais des réserves ont été émises quant à son activité en matière d’armes microbiologiques.

En 1991-1992, lors de la première guerre du Golfe, l’Irak a menacé d’utiliser les armes biologiques. En 1995, le Général Hussein Kamel Hassan a révélé l’existence d’un programme de recherche, d’expérimentation et de production depuis 1974. Le gouvernement irakien aurait produit 90 000 litres de toxine botulique, 8 300 litres d’agents de la fièvre charbonneuse, 2 400 litres d’aflatoxine et aurait fabriqué 200 têtes de missile et de bombes aériennes chargées de ces agents. Il aurait aussi possédé des pulvérisateurs et des systèmes de dissémination pouvant générer un flux de 2 000 litres à l’heure (31, 93). L’Irak a également indiqué avoir disposé de 182 « munitions biologiques » et avoir six sites impliqués dans le programme. En 1996, malgré le démantèlement après la guerre, la Commission spéciale des Nations Unies, l’UNSCOM, a indiqué que l’Irak posséderait entre six et 16 missiles munis d’ogives adaptées à l’attaque biologique.

De 1981 à 1993, l’Afrique du Sud possédait également un programme de recherche et de production sur les armes biologiques et chimiques : le projet « Coast ». Il a été rendu public

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en 1998. Outre les recherches classiques offensives, un des objectifs de ce projet était de produire des agents biologiques par le biais de l’ingénierie génétique afin de baisser le taux de natalité des populations noires.

Dernièrement, en mars 2002, l’armée américaine en Afghanistan a découvert un laboratoire destiné à la fabrication d’armes bactériologiques (93).

3.1.1.5.4. Le terrorisme

Les agents biologiques intéressent également les terroristes mais on ne compterait pas

plus d’une vingtaine de menaces ou d’attentats sur le plan mondial depuis les années 1970. Ces actions seraient souvent des tentatives vouées à l’échec dans la mesure où les

terroristes préfèreraient les actions sanglantes qui attirent l’attention. Cependant, les attentats du 11 septembre 2001 et les lettres « piégées à l’anthrax » ont déclenché une telle psychose que les spécialistes pourraient revoir leur jugement.

Voici, pour exemples, quelques tentatives d’acquisition et d’utilisation d’armes biologiques selon le rapport sur le terrorisme biologique du Service Canadien du Renseignement de Sécurité. En 1974, le groupe terroriste américain Weather Underground a tenté de faire chanter un officier des installations de guerre bactériologique à Fort Detrick, pour obtenir des agents pouvant contaminer l’eau. En 1989, un pharmacologiste iranien a fait des demandes pour obtenir des souches de Fusarium au Canada et auprès du Bureau Central des cultures de champignons des Pays Bas. Celles-ci ont été refusées. Dans les années 1980, on a découvert un « mini » laboratoire de la Faction de l’Armée Rouge à Paris, une baignoire contenant des flacons de toxine botulique. En 1984, la secte de Rajneesh aurait contaminé le bar à salades d’un restaurant en Oregon avec Salmonella typhimurium, 750 personnes ont été intoxiquées. En 1993, la secte Aum Shinrikyo a essayé, sans succès, de répandre des spores de charbon à partir du toit d’un immeuble de Tokyo ; la secte travaillait sur l’agent du charbon mais aussi sur celui de la fièvre Q et sur la toxine botulique (31, 93). En 1998, le FBI a arrêté un biologiste d’extrême droite en possession de 50 kg d’agent de la fièvre charbonneuse sur dénonciation de la personne à laquelle il voulait acheter du matériel de laboratoire (93).

Tableau VIII: exemples récents de bioterrorisme (50).

Date Groupe/évènement Agent utilisé 1952 Mau Mau Toxine « African Milk Bush »

Synadenium grantii 1972 Sun Rise Order Salmonella typhi 1973 Savants fous allemands Bacillus anthracis, toxine

botulique 1981 « Dark Harvest » Bacillus anthracis 1984 M.A. Sheela Salmonella typhimurium De 1990 à 1995

« Aum Shinrikyo » Divers agents

1995 L. Harris Yersinia pestis 1997 Boîte de Pétri, synagogue de Washington Bacillus anthracis 1998 Canulars sur la côte Ouest Bacillus anthracis

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Tableau IX : activités et attentats perpétrés par la secte « Aum Shinrikyo » entre 1990 et 1995 (31, 50).

Date Action Agent 1990 Premier attentat biologique Toxine botulique 1992 Acquisition de virus lors d’une

mission « humanitaire » au Zaïre Virus Ebola

1993 Autres attentats biologiques Toxine botulique et Bacillus anthracis

1994 Production d’agent chimique Sarin Détention Sarin, VX, Bacillus anthracis,

toxine botulique, Coxiella burnetii, virus Ebola

Attentat Sarin

Attentat Toxine botulique

Alerte internet

1995 : 5 mars 15 mars 19 mars 20 mars Attentat dans le métro de Tokyo Sarin

Tableau X : agents de programmes biologiques offensifs et agents associés à des biocrimes et à du bioterrorisme (Seth CARUS, Bioterrorism and biocrimes, august 1998) (50).

Agents de programmes biologiques offensifs

Agents associés à des biocrimes et à du bioterrorisme

Pathogènes Bacillus anthracis Coxiella burnetii Yersinia pestis Brucella suis Francisella tularensis Variole Encéphalites virales Fièvres hémorragiques Ebola et autres

Bacillus anthracis Coxiella burnetii Yersinia pestis Rickettsia prowazekii Salmonella typhimurium Salmonella typhi Shigella sp. Vibrio cholerae Yersinia enterocolitica Ebola Virus de la fièvre jaune Virus des fièvres hémorragiques Virus du SIDA

Toxines Toxine botulique Ricine Entérotoxines de Staphylocoques B

Toxine botulique Ricine Endotoxine cholérique Toxine diphtérique Nicotine Toxines de venin de serpents Tétrodotoxine

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Aux Etats-Unis, après les attentats du 11 septembre 2001 et la destruction du World Trade Center, des lettres contenant des spores de Bacillus anthracis ont été envoyées à plusieurs personnes de la presse et du gouvernement américain. Des postiers ont été contaminés, 14 personnes ont été atteintes par des formes cutanées ou pulmonaires et cinq personnes sont décédées. Les spores retrouvées dans les courriers correspondaient à des souches militarisées (souches enrobées de silicates (50)) produites au centre d’essais militaires de Dugway. D’après le FBI, le responsable pourrait être un scientifique américain. Depuis le mois de mai 2002, le service d’investigation d’Intelligence On-Line sur internet a déclaré dans les médias que les lettres auraient été envoyées par une secte : l’Army of God qui milite contre l’avortement et qui a l’habitude depuis quelques années d’envoyer ce type de courrier à travers les Etats-Unis (93).

L’usage des armes biologiques remonte à l’Antiquité : de façon empirique des phénomènes pathologiques ont pu être reproduits à des fins meurtrières. La découverte des microorganismes et, notamment, les travaux de Pasteur ont ensuite donné aux armes biologiques leurs bases modernes.

Les premières tentatives d’utilisation militaire remontent à la première guerre mondiale mais c’est à partir de 1930 que l’emploi à grande échelle des armes biologiques est réellement envisagé, et ce, dans de nombreux pays (Japon, Chine, Grande Bretagne, Allemagne, URSS, Etats-Unis).

Depuis la seconde guerre mondiale, bien que la plupart des pays aient officiellement renoncé à produire des armes biologiques, celle-ci a officieusement continué pendant de nombreuses années, notamment aux Etats-Unis et en URSS. Aujourd’hui, 17 pays sont encore soupçonnés de posséder des armes biologiques.

Par ailleurs, ces armes ne concernent pas que les militaires, elles intéressent également les terroristes même si, jusqu’à présent, toutes les tentatives n’ont eu qu’un impact limité.

3.1.2. Les agents pathogènes présentant un risque biologique pour l’Homme

Le risque d’un agent biologique correspond au danger qu’il représente pour l’environnement et la santé publique. Celui-ci est inhérent à la gravité de la maladie qu’il provoque, à sa virulence, à son infectiosité, à son temps d’incubation et aux protections possibles (thérapie, vaccin) (93). On peut ainsi diviser les agents pathogènes en quatre groupes (classification d’Euzéby J.P. basée sur les arrêtés publiés au Journal Officiel et sur les textes communautaires) (39) :

- groupe de risque 1 (faible risque pour les individus et la collectivité) : il s’agit d’agents qui peuvent, de façon peu probable, générer une maladie chez l’Homme et les animaux sains.

- groupe de risque 2 (risque modéré pour les individus et limité pour la collectivité) : cette catégorie correspond aux agents pathogènes qui peuvent générer une maladie chez l’Homme et les animaux, mais sans danger grave, dans des

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circonstances normales ; des traitements existent et le danger de propagation est limité. On peut citer comme exemples Actinobacillus, Bordetella bronchiseptica, Clostridium botulinum, Mycobacterium paratuberculosis, Francisella tularensis type B, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, etc, en ce qui concerne les bactéries. Parmi les virus, on trouve le virus de la grippe (A, B, C), la vaccine, le virus de la rougeole ou encore celui des oreillons.

- groupe de risque 3 (risque élevé pour les individus, risque faible pour la collectivité) : ce sont des agents qui peuvent générer une maladie grave chez l’Homme et les animaux, ou avoir des conséquences économiques importantes. La maladie ne se propage cependant pas par contact entre deux personnes et les thérapeutiques usuelles sont efficaces. On classe dans ce groupe des agents tels que Bacillus anthracis, Brucella abortus, Brucella melitensis 1, Brucella suis, Brucella canis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Coxiella burnetii, Francisella tularensis type A, Mycobacterium bovis (sauf Bacille de Calmette et Guérin (BCG)), Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Salmonella typhi, Yersinia pestis, etc. Quant aux virus, on peut trouver dans ce groupe le virus de la variole du singe, le virus West Nile, celui de Hantaan, de la fièvre de la vallée du Rift, de la dengue, de la fièvre jaune, des encéphalites équines, par exemples.

- groupe de risque 4 (risque élevé pour les individus et la collectivité) : les agents de ce groupe sont responsables de maladies graves chez l’Homme et les animaux. Elles se transmettent par contact direct ou indirect d’une personne à une autre, d’un animal à l’Homme ou inversement. Il n’y a que des virus dans ce groupe : ceux des varioles blanche, majeure et mineure, celui de Junin, Lassa, Machupo, Marburg, Ebola, de la fièvre de Crimée/Congo.

Ainsi, la majeure partie des agents utilisables dans le cadre intentionnel appartiennent aux

groupes 3 et 4. Les Centers for Disease Control and prevention (CDC) proposent une autre classification,

basée sur la gravité liée à une diffusion intentionnelle des différents agents (15): - catégorie A : elle regroupe des agents pouvant être aisément disséminés ou dont la

transmission se fait de personne à personne. Ces agents entraînent également une mortalité élevée et ont un impact majeur en terme de santé publique. Leur dissémination déclencherait des mouvements de panique au sein de la population. Ces agents doivent donc faire l’objet d’un plan spécifique de prévention. Figurent ainsi dans cette catégorie des agents tels que Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, la toxine de Clostridium botulinum, le virus de la variole ainsi que ceux des fièvres hémorragiques (filovirus, arenavirus).

- catégorie B : la diffusion des agents de cette catégorie est modérément aisée, les taux de mortalité et de morbidité sont modérés voire faibles. Ainsi, seul un renforcement des moyens de diagnostic et de surveillance est prévu. Cela concerne les agents de la brucellose, de la mélioïdose, de la psittacose, de la fièvre Q, du typhus, des encéphalites virales auxquels viennent s’ajouter la ricine, la toxine epsilon de Clostridium perfringens et l’entérotoxine B staphylococcique.

- catégorie C : cette catégorie inclue les agents pathogènes émergents qui pourraient être disséminés de façon massive du fait de leur accessibilité, de la facilité de leur production et de leur diffusion associée à un impact majeur sur la santé publique : il s’agit plus particulièrement des virus Hanta et Nipah.

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On peut également établir une classification basée sur l’espèce cible (98) : - classe I : maladies spécifiquement humaines (exemple : la variole). - classe II : maladies spécifiquement animales (exemples : la fièvre aphteuse, la peste

bovine). L’utilisation de tels agents aurait un impact économique majeur. - classe III : maladies communes à l’Homme et à l’animal (exemples : le botulisme, le

tétanos, la gangrène gazeuse). - classe IV : infections et infestations naturellement intertransmissibles de l’animal à

l’Homme et inversement, ce sont les zoonoses (exemples : la fièvre charbonneuse, la brucellose, la tularémie, la fièvre Q, les encéphalites équines, etc.).

Trois classifications semblent pertinentes pour regrouper les différents agents : la première classe les agents en fonction du danger qu’ils représentent pour la Santé Publique et l’environnement (elle constitue la base des niveaux de biosécurité), la deuxième est plus représentative du danger liée à une dissémination intentionnelle de ces agents et la troisième est basée sur l’espèce ou les espèces cibles.

3.1.3. Choix d’une arme biologique : militarisation des agents pathogènes

3.1.3.1. Les critères de Rosbury

Pour qu’un agent pathogène soit utilisable dans le cadre militaire, Théodore Rosbury, en 1949, a défini qu’il devait répondre aux critères suivants :

une dose minimale infectante. une période d’incubation courte pour une action rapide. une virulence forte provoquant une maladie grave, mortelle ou incapacitante. une contagiosité limitée pour ne pas générer une épidémie non contrôlée pouvant

contaminer les troupes attaquantes. l’absence d’immunité dans la population cible. la capacité de résister dans l’environnement lors de la dispersion. une aptitude de l’agent à la dispersion. des facilités de production, de stockage, de transport, et de stabilité lors de ces étapes. une détection et une identification difficile. l’absence de vaccin. l’absence de thérapeutique spécifique, par exemple, une résistance aux antibiotiques

classiques. une protection possible pour les troupes attaquantes.

Certains de ces critères sont contradictoires : il est difficile de protéger ses troupes contre

un agent pour lequel il n’existe ni vaccin ni thérapeutique ! Les critères les plus importants pour l’exploitation d’un agent sont sa facilité à être produits et sa résistance lors de sa dispersion (93).

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3.1.3.2. Avantages et inconvénients

L’avantage majeur de l’arme biologique est son faible coût : elle est d’ailleurs, à ce titre, souvent qualifiée « d’arme nucléaire du pauvre » (31, 50). Selon le Service Canadien de Renseignements de Sécurité, il faut, 2 000 dollars par kilomètre carré avec des armes conventionnelles, 800 avec l’arme nucléaire, 600 avec une arme chimique et un dollar avec une arme biologique (31, 93).

Ensuite, la production est facile : avec des fermenteurs équivalents à ceux utilisés pour la fermentation de la bière, on peut produire des bactéries de façon massive. En Russie, en 1987, Stepnogorsk produisait 5 000 tonnes d’agent de la fièvre charbonneuse par an. Toutefois, il faut maîtriser la technique et posséder le matériel. Mais, il est relativement facile de dissimuler des installations consacrées à la production d’armes microbiologiques sous couvert d’activités civiles.

L’emploi d’armes bactériologiques, que l’on pourrait qualifier de « bombes propres », permet de ne pas léser les infrastructures de la zone cible. Leur action peut être également variable, de la mort à l’incapacité, et ciblée sur l’Homme, les animaux voire les végétaux. L’utilisation de telles armes peut permettre de neutraliser une armée sans en tuer les soldats si l’on utilise un agent non létal.

De plus, ces armes sont difficilement détectables car la technicité des détecteurs est encore limitée en termes de spécificité et de fiabilité. En effet, ils ont un spectre de recherche limité.

Enfin, une attaque bactériologique a un impact psychologique très important sur la population dans la mesure où elle fait rejaillir la peur ancestrale attachée aux grandes épidémies, risquant d’engendrer des phénomènes de paniques collectives incontrôlables.

Les inconvénients majeurs des agents biologiques sont leur caractère imprévisible : en fonction des conditions climatiques et des cibles, l’effet recherché n’est pas garanti.

De plus, des agents comme l’anthrax peuvent persister longtemps sur la zone cible. Ils sont également dangereux pour ceux qui les manipulent.

Enfin, l’opinion publique est contre l’emploi de telles armes et leur utilisation entraînerait une riposte acharnée (93).

3.1.3.3. Intérêts tactiques

Les agents microbiologiques peuvent servir pour des frappes avec pertes ennemies ou simplement pour mettre l’adversaire hors de combat. Leur action semble trop lente et imprévisible, pour que ces armes soient utilisées comme des armes d’attaque surprise. Par contre, elles peuvent servir dans les guerres d’usure, comme armes stratégiques, pour atteindre les forces de réserve ou des adversaires repliés dans des endroits inaccessibles aux forces terrestres et aux moyens conventionnels de guerre. Pour ce genre d’usage, il est préférable d’employer des agents sans possibilité de reproduction comme les toxines ou des agents sans contagiosité interhumaine, comme le charbon.

La menace d’avoir recours à une arme bactériologique est aussi un moyen de pression sur les adversaires et un moyen de les déstabiliser car c’est les obliger à prendre des mesures de protection et à organiser la riposte avec toutes les éventualités possibles.

Si le but est de déclencher une épidémie, dans le cadre d’une destruction massive de la population militaire et civile, il faut connaître la chaîne épidémiologique au niveau de la zone cible : la sensibilité de la population, les voies d’infection, les réservoirs et les espèces vectrices.

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Dans le cas d’attaques terroristes, l’intérêt principal de ce type d’armes semble être le déclenchement d’une maladie suspecte qui engendrera la panique et qui pourrait désorganiser les services de santé et la structure d’un Etat. La période d’incubation des diverses maladies permettrait aux auteurs de l’attentat de se préserver des représailles directes (93).

Pour qu’un agent pathogène soit utilisable en tant qu’arme biologique, il doit répondre à un certain nombre de critères. Ces critères ont été définis, en 1949, par Théodore Rosbury.

Les avantages des armes biologiques par rapport aux armes conventionnelles sont : faible coût, facilité de production (pour les bactéries du moins), dissimulation possible des installations sous couvert d’industries civiles, absence de destruction des infrastructures lors de leur utilisation, possibilité d’incapaciter sans tuer les forces armées ennemies, difficultés de détection, impact psychologique sur les populations.

Par contre, leur caractère imprévisible, leur éventuelle persistance sur la zone, la nécessité de maîtriser les techniques de production ainsi que la mauvaise image des armes biologiques vis-à-vis de l’opinion publique sont autant d’inconvénients qui limitent leur utilisation.

De plus, leur délai d’action, trop long, les rend inutilisables pour une attaque surprise, elles seraient plutôt utilisées lors de guerres d’usure pour atteindre les forces de réserve ou comme moyen de pression et de déstabilisation.

Dans un cadre terroriste, l’utilisation d’agents pathogènes, engendrant la panique, désorganiserait les services de santé ainsi que la structure de l’Etat concerné.

3.1.4. Elaboration d’une arme biologique

3.1.4.1. Acquisition

Les Etats peuvent se procurer des souches dans le cadre d’activités civiles et les détourner pour des objectifs militaires. L’American Type Culture Collection de Rockville (ATCC) dans le Maryland est un fournisseur officiel : les scientifiques peuvent passer commande par un simple courrier et recevoir les souches par la poste, sous couvert de la demande officielle de leur établissement, la description de leurs travaux et la justification de l’équipement requis pour l’utilisation de la souche. Les mesures de vérification des commandes se sont renforcées depuis certains incidents. On sait que la secte Rajneesh avait réussi à commander à l’ATCC, via leur dispensaire, des souches de Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Francisella tularensis, d’Enterobacter cloacae, Neisseria gonorrhoeae et de Shigella dysenteriae. Les sources naturelles peuvent être un moyen de se procurer des souches. Toutes les zones d’endémies ou d’enzooties, dans le monde, peuvent être des réservoirs d’agents pathogènes (50, 93). On sait, par exemple, que les Russes ont récupérés des virus Ebola et de Marburg en Ouganda et en Allemagne.

Les terroristes peuvent utiliser les mêmes méthodes pour acquérir des souches pathogènes, grâce à un gouvernement ami ou de scientifiques ou bien encore voler ces souches dans un établissement de recherche, un laboratoire universitaire ou dans les

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laboratoires pharmaceutiques (50, 93). Depuis le démantèlement de l’URSS, les souches de bactéries et de virus pathogènes sont à peine gardées. Les terroristes peuvent aussi se servir des échanges scientifiques, par exemple, à partir de serveurs internet, pour trouver non seulement les fournisseurs mais aussi le mode d’emploi pour cultiver ces agents (93).

3.1.4.2. Production

Après avoir sélectionné une souche pathogène, il faut évaluer ses aptitudes : sa virulence, sa résistance, la dose minimale infectante, sa capacité éventuelle de sporulation, ses capacités de reproduction, tout cela par le biais d’études sur des quantités limitées.

La culture des bactéries se fait sur des milieux spécifiques en fonction des exigences de l’espèce bactérienne (voire de la souche). Il faut leur fournir a minima de l’énergie, du glucose, des acides aminés, des facteurs de croissance comme des vitamines, des coenzymes, des minéraux (phosphates, chlorure de potassium, sodium) et des oligo-éléments (magnésium, fer, manganèse, cobalt). Il faut également tenir compte du pH, de la pression osmotique et du potentiel d’oxydoréduction du milieu. La virulence et la résistance aux antibiotiques, entre autres, peuvent être modifiées en jouant sur les conditions de culture.

La production industrielle peut être réalisée dans des fermenteurs qui sont, en fait, des cuves métalliques où l’on mélange l’inoculum, les substances nutritives et des catalyseurs biologiques pour obtenir un milieu optimal. Ce type de matériel est utilisé dans les brasseries, dans l’industrie des produits laitiers ou encore dans celle de la fabrication de la levure pour la boulangerie (93). Ainsi, une simple yaourtière peut suffire pour obtenir la multiplication des bactéries même si c’est en petites quantités (50). Le pH est surveillé, la température contrôlée avec un système de réfrigération et le mélange est homogénéisé par un système de pales ou de turbines. L’aération est indispensable pour les bactéries aérobies mais elle provoque la formation de mousses, contrôlée par l’adjonction de produits tensioactifs (93). Les bactéries produites sont récupérées à la sortie du fermenteur. La production peut s’effectuer en culture discontinue ou Batch, le fermenteur est alors fermé aux échanges et tous les substrats nécessaires sont apportés au départ ; lorsque la concentration maximale en microorganismes est atteinte, les bactéries sont récupérées et centrifugées pour les concentrer. Il est possible de les lyophiliser pour les conserver, mais cela implique une perte de virulence avec le temps.

Puis, pour les stabiliser, il faut ajouter des additifs comme des anti-agglomérants. On peut utiliser la technique de microencapsulation, qui consiste à envelopper les agents dans des revêtements de gélatine, de cellulose ou de polymère. La microencapsulation permet la protection contre la lumière, l’oxygène et la dessiccation. On peut choisir la concentration des microorganismes dans les microcapsules, définir leur taille et obtenir ainsi une libération contrôlée des agents pathogènes lors de la dissémination.

Pour la culture des virus et de certaines bactéries intracellulaires strictes, il faut des tissus vivants. La technique la plus courante est l’utilisation d’œufs embryonnés. L’œuf est inoculé par injection de virus dans la membrane chorio-allantoïdienne, dans le sac vitellin ou la cavité amniotique. Puis, la coquille est bouchée à la paraffine et l’œuf est placé dans un incubateur. Après multiplication des agents, le liquide amniotique peut être utilisé tel quel ou alors, on peut procéder à une ultracentrifugation, ce qui permet l’isolement, le transport dans des cuves et la stabilisation par des agents chimiques. Les virus peuvent être conservés par congélation.

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La culture cellulaire peut s’effectuer dans des récipients en verre, des boîtes de Pétri ou sur des microbilles. Le milieu doit contenir des minéraux, des acides aminés, des vitamines, des facteurs de croissance et des antibiotiques. Les cultures peuvent être issues :

de cellules primaires, par exemple des cellules de rein de singe rhésus, mais, au bout de quelques passages, ces cellules meurent.

de cellules diploïdes, isolées de cultures primaires, qui supportent une cinquantaine de passages.

de cellules en lignée continue : après mutations, ces cellules supportent un nombre de passages illimité, c’est le cas de la lignée Véro, isolée d’une culture primaire de rein de singe vert.

Les cultures sont utilisées pour la production industrielle, elles sont placées dans des réacteurs, les cellules sont brassées et alimentées comme les bactéries dans les fermenteurs.

Lorsque les cultures bactériennes ou virales sont prêtes en quantité suffisante, le problème majeur des microbiologistes spécialisés dans ce type d’armement se pose : il faut pouvoir les utiliser donc les disséminer de la façon la plus efficace possible, en conservant une virulence suffisante (93).

3.1.4.3. Moyens de propagation

Une attaque biologique peut s’orchestrer de diverses façons. Il est possible de disséminer les agents dans l’environnement à ciel ouvert, mais aussi en milieu fermé comme dans un immeuble ou le métro, de contaminer des aliments, des points d’eau, de transmettre des agents par des vecteurs tels que des insectes, des rats (50, 93), par des matières inertes, dans du courrier, ou par un contact direct interhumain (93).

La dissémination par voie aérienne est possible par le biais de bombes ou de missiles qui seraient libérés sur les objectifs pour obtenir une contamination massive. Il faut des explosions de faible puissance pour ne pas détruire les microorganismes (93). De plus, il est nécessaire de protéger l’agent à l’intérieur du dispositif, sinon l’inactivation peut atteindre 99% (50).

Les agents peuvent aussi être disséminés par pulvérisation en utilisant par exemple de l’air comprimé (50, 93) mais les pulvérisateurs génèrent des particules dont la taille est 20 fois supérieure à la taille optimale, ce qui donne au dispositif une efficacité moyenne (50). Les aérosols doivent être concentrés pour disperser une dose létale d’agent de façon rapide, avec des tailles de particules de un à cinq microns pour que leur action s’exerce au niveau des alvéoles pulmonaires (50, 93).

L’épandage direct par des avions ou des hélicoptères comme ceux utilisés dans l’épandage des pesticides est la méthode de choix (50, 93). La pulvérisation doit se faire à faible altitude, avec de grandes quantités (50), pour que les agents puissent se répandre sur l’objectif. Les conditions de température doivent être optimales, avec une hygrométrie de 70%. Si l’épandage est fait de nuit ou le matin, le nuage va rester entre la couche d’air froid proche du sol et les couches d’air supérieures plus chaudes. Ainsi, l’épandage est assujetti aux conditions climatiques, à la pression atmosphérique, aux vents, à l’hygrométrie et à l’ensoleillement. Selon une étude de l’Office of Technology Assessment, un petit avion équipé d’un diffuseur utilisé pour l’agriculture, répandant 100 kg d’anthrax sur Washington, avec des conditions climatiques optimales (temps clair, de nuit), pourrait tuer un à trois millions de personnes (31, 93).

La contamination du système de ventilation dans un métro ou un immeuble nécessite de petites quantités d’agents et l’on peut imaginer l’utilisation d’un simple diffuseur à air

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comprimé (50, 93). Mais là encore, on se heurte à des difficultés : il faut connaître le réseau et préserver les agents utilisés car le taux de décroissance moyen dans l’air pour une bactérie est de 10%, et de 30% pour un virus (50).

Tableau XI : hypothèses de dissémination par avion de 50 kg d’agents sur une ligne de deux kilomètres, au niveau d’une ville de 500 000 habitants (50).

La contamination de l’eau dans une agglomération est assez difficile (50, 93) car il faut de grandes quantités d’agents qui peuvent être inactivés par la chloration. Théoriquement, 28 à 56 grammes de toxine botulique dans un réservoir de 38 millions de litres pourraient tuer une personne qui boirait un demi-litre d’eau, mais, en pratique, il faut que la toxine se répartisse de façon homogène dans le réservoir et le fait de porter l’eau à ébullition la détruit (93).

La contamination d’aliments sur les zones de production est envisageable (50, 93). C’est un moyen intéressant pour un acte terroriste, car il pourrait permettre le sabotage d’une industrie alimentaire dont certains secteurs sont particulièrement vulnérables (industrie laitière notamment). 30 grammes de ricine, par exemple, sont suffisants pour empoisonner mortellement un lot de 150 livres de viande permettant de produire 1 500 hot-dogs (31). Cependant d’autres auteurs sont beaucoup moins alarmistes et considèrent que l’opération serait de faible envergure, car les autorités et les hôpitaux sont sensibilisés aux intoxications alimentaires ; ils seraient donc en mesure de détecter assez rapidement une contamination des denrées alimentaires (50, 93)

Agent Aire de dissémination (km) Décès Personnes incapacitées

Fièvre de la vallée du Rift 1 400 35 000 Encéphalites à tiques 1 9 500 35 000

Typhus 5 19 000 85 000 Brucellose 10 500 100 000 Fièvre Q >20 150 125 000

Tularémie >20 30 000 125 000 Charbon >>20 95 000 125 000

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L’élaboration d’une arme biologique comporte trois phases : - l’acquisition des agents pathogènes : les Etats peuvent se les fournir via leurs activités civiles de recherches scientifiques. Les zones d’endémies ou d’enzooties peuvent également constituer des sources naturelles intéressantes. Les terroristes peuvent employer les mêmes circuits d’approvisionnement grâce à un gouvernement ami ou à des scientifiques ralliés à leur cause.

- la production : ¤ pour les bactéries : il faut sélectionner les souches puis évaluer leurs performances. La production se fait dans des fermenteurs contenant un milieu nutritif adapté. Enfin, les agents sont conservés par lyophilisation ou par microencapsulation. ¤ pour les virus et les bactéries intracellulaires : la culture est réalisée sur œufs embryonnés ou sur lignées cellulaires, l’agent est ensuite concentré par ultracentrifugation puis stabilisé. - la propagation : ¤ par diffusion aérienne : on peut avoir recours à des missiles ou à des bombes mais il faut protéger l’agent à l’intérieur du dispositif, et veiller à ce que les explosions soient de faible puissance. La dissémination par pressurisation peut aussi être envisagée mais la taille des particules est souvent supérieure à celle voulue. La méthode de choix est l’épandage direct même s’il faut respecter un certain nombre de contraintes (épandage à faible altitude, grande quantité d’agent, température, hygrométrie de 70%). On peut aussi penser à la diffusion en milieu clos, comme les systèmes de ventilation mais il faut connaître les réseaux et pouvoir protéger les agents contre les différentes sources d’inactivation. ¤ par contamination de l’eau : cela semble difficile dans la mesure où il faut une grande quantité d’agents, qui peuvent par ailleurs être inactivés par la chloration. ¤ par contamination des aliments : ce type d’acte terroriste perpétré sur les zones de production serait sans doute de faible envergure compte tenu des procédures de contrôle et de l’habitude qu’ont les professionnels en matière d’intoxication alimentaire.

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3.2. Fièvre Q : la cible humaine

Bien qu’étant une maladie très répandue chez l’animal, la fièvre Q n’est pas utilisable, en tant qu’arme, sur ce type de cible car les conséquences médicales et économiques sont pratiquement nulles.

A première vue, Coxiella burnetii ne semble pas non plus être l’agent de choix pour une attaque biologique dirigée contre l’Homme, qu’elle soit militaire ou terroriste. En effet, seulement 40% des personnes infectées présentent des symptômes, la mortalité est limitée (1% pour la forme aiguë, 15% pour la forme chronique) et la période d’incubation est longue (dix à 40 jours pour la forme aiguë, jusqu’à plusieurs années pour la forme chronique) (10, 27, 93, 105).

Cependant, de nombreux gouvernements, dont la France, ne négligent pas la menace potentielle liée à cet agent car, s’il n’est pas létal, son pouvoir incapacitant est important (10).

De plus, le quantum infectieux est très faible : une à dix bactéries suffisent à infecter l’Homme par voie respiratoire (10, 21, 27, 93). On évalue que 50 kg de Coxiella burnetii sous la forme de poudre séchée pourraient causer autant de victimes qu’une quantité identique d’anthrax ou d’agents de la tularémie (10).

La contamination, lors de l’infection naturelle, se fait principalement par voie respiratoire (et digestive), ce qui correspond au mode de dissémination le plus efficace en terme d’attaque biologique.

D’autre part, Coxiella burnetii est très résistante dans le milieu extérieur, par conséquent, sa dissémination peut se faire sur de grandes distances et sa persistance dans le milieu est longue. Elle résiste également à de nombreux agents physico-chimiques : la décontamination des différents milieux est donc difficile (93, 20, 88, 134).

Ensuite, la contagion interhumaine est très rare, ce qui peut être un inconvénient si l’on souhaite répandre largement la maladie, ou un avantage si l’on veut garder une certaine maîtrise de l’arme que l’on emploie.

Par ailleurs, le diagnostic de fièvre Q est difficile à établir. Cette difficulté est encore accentuée dans la mesure où les effets de l’agent sont différés dans le temps (111).

Enfin, le traitement spécifique, même s’il est efficace, est un traitement long, contraignant, qui n’exclut pas totalement l’apparition de complications (77).

Tous ces éléments amènent à conclure à une possible utilisation de Coxiella burnetii dans le cadre du risque biologique provoqué et notamment dans le cadre du risque criminel.

Le faible quantum infectieux, le mode de contamination par voie respiratoire, la grande résistance de l’agent dans le milieu extérieur ainsi que son pouvoir incapacitant font que Coxiella burnetii doit être considérée comme un agent potentiellement utilisable comme arme biologique.

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3.3. Les moyens de contrôle

Les mesures sont : - bénéficier de services de renseignements pour les prévoir. - mettre au point des dispositifs technologiques de protection. - mettre en œuvre des protocoles internationaux qui empêchent l’utilisation d’agents

microbiologiques. La surveillance des activités des pays soupçonnés de faire des recherches sur les armes

biologiques et la surveillance des groupes terroristes permettent d’estimer les risques. Elle consiste à vérifier les commandes de matériels de production massive tels que les fermenteurs, et à contrôler les transferts et les recherches sur les souches pathogènes, les mouvements des scientifiques et des techniciens connus pour travailler dans ce domaine.

La protection contre un acte terroriste est plus illusoire car on ne sait pas quand l’acte va se dérouler et les plans d’attaques sont multiples. Une protection efficace consiste en la mise en place d’une logistique adaptée pour la gestion d’un accident microbiologique : dispositifs de détection, plan d’épidémiosurveillance pour la population, moyens de décontamination, traitements et mesures pour limiter les contaminations secondaires, vaccins pour les militaires (93).

3.3.1. Moyens techniques

3.3.1.1. Cadre général 3.3.1.1.1. Moyens de détection

La détection est le maître-mot en matière de défense biologique, en effet, c’est elle qui

permet : dans un premier temps d’infirmer ou de confirmer l’attaque. En cas de confirmation, le

ou les agents biologiques utilisés doivent être identifiés de manière précise. dans un deuxième temps, de délimiter la zone de contamination. dans un troisième temps, de lever les mesures de protection adaptées et de traiter le

personnel et de décontaminer l’environnement. Le processus de détection fait appel à différentes technologies :

détection non spécifique capable de distinguer en continu une variation des caractéristiques du bruit de fond des aérosols.

détection générique capable de confirmer en continu la présence de particules biologiques ou de molécules constitutives d’agents biologiques :

FLAPS (Fluorescent Aerodynamic Particle Sizer). bioITMS (Biological Ion Trap Mass Spectrometer). luminomètre. sonde biologique.

détection spécifique pour identification précise : ces systèmes utilisent une réaction de liaison avec des anticorps spécifiques, la visualisation de la réaction se faisant au moyen d’un transducteur adapté (électrochimique, optique, colorimétrique, masse) :

LAPS (Light Adressable Potentiometric Sensor) : système immunologique mesurant une variation de pH. Il est automatique et permet la détection simultanée de huit agents.

cytométrie en flux : comptage optique des particules. Ce système peut être utilisé en détection et en identification (au moyen d’anticorps).

ADIBIO (Automate de Détection et d’Identification des Biocontaminants). Tickets détecteurs du type SMARTTICKET.

biocollection qui concentre et collecte les échantillons dans un milieu approprié.

94

Les qualités souhaitées pour ces appareils sont nombreuses : ils doivent être peu encombrants, facilement portables ou transportables, faciles d’entretien, d’une grande autonomie, rapides, de préférence automatisés ou d’un fonctionnement aisé, dotés d’une grande sensibilité et d’une spécificité élevée, donnant un résultat non ambigu, robustes et fiables (52).

Lorsque l’attaque biologique (par aérosols) est confirmée, il faut pouvoir déterminer les zones à risques, l’heure d’arrivée du nuage d’agent biologique, la durée d’exposition au nuage de façon à protéger les unités et à lever l’alerte pour faciliter la manœuvre en retirant les effets de protection au port contraignant. Les mesures à prendre dépendent de l’efficacité et de la persistance de l’attaque, qui sont sous l’influence de nombreux facteurs de l’environnement jouant sur la décroissance biologique et sur l’importance de la dispersion. Les dimensions de la zone d’attaque doivent être connues pour permettre de définir les différentes zones (29):

zone d’alerte immédiate à haut risque, où le nuage d’aérosol à forte concentration microbienne provoquera de fortes pertes sur du personnel non protégé. Les contre-mesures médicales ne pourront être prises qu’après identification de l’agent.

zone sous le vent, à risque réduit.

Figure 11 : gabarit d’une attaque ponctuelle (29).

Centre de l’attaque (R = 1 km)

30°

H+1h, minimum 15 km.

H+3h, détection biologique.

H+Xh.

ZONE à RISQUES limités ZONE à RISQUES

élevés

Durée de vie de l’agent.

DIRECTION DU VENT

95

De plus, l’environnement (air, faune, flore, état de santé de la population locale) et les ressources alimentaires (notamment l’eau de boisson) doivent être surveillés (29, 52, 93).

Dans un contexte de menace biologique mais sans attaque avérée, un suivi épidémiologique des populations militaires et civiles doit être envisagé ; une attaque est possible si (93) :

une épidémie apparaît de façon inexpliquée. beaucoup de cas sont regroupés dans l’espace et dans le temps. la maladie se présente sous une forme respiratoire. le mode de contamination ne correspond pas au mode naturel. les malades sont répartis selon les vents dominants.

3.3.1.1.2. Moyens de protection des forces armées face à une attaque biologique

Les militaires de l’Armée de Terre disposent de deux tenues de combat NBC (Nucléaire,

Biologique et Chimique), d’un masque à gaz, de sur-bottes de protection, de sous-gants, de chaussettes carbonées et de gants de cuir (annexe 6). Ils disposent également de tenues légères destinées au personnel participant aux opérations de décontamination (annexe 7). Certaines forces, comme la Marine, ont des masques équipés d’appareils respiratoires avec des cartouches filtrantes.

Des véhicules militaires sont équipés de systèmes de filtration et de pressurisation (29), les autres sont bâchés en cas d’attaque (93).

Tableau XII : niveaux de protections individuelle et collective (52).

T3P : Tenue de protection à port permanent. A.N.P.V.P. : Appareil normal de protection à vision panoramique (masque).

Niveaux Moyens 1 2 3 4 4 bis

Niveau de la menace Nul faible moyen élevé élevé

Protection individuelle Tenue NBC (T3P)

Non revêtu Non revêtu

Revêtu en position ouverte

Revêtu en position fermée

Capuche ouverte

Gants de cuir Non portés Non portés Portés Portés Portés

Sous-gants Non portés Non portés Carbonés Carbonés Carbonés

Chaussettes carbonées Non portées Non portées Portées Portées Portées

A.N.P.V.P. / Position de transport

Position de combat

Position protection

Position protection

Protection collective Engins dotés d’un

système / Filtres en

place

Véhicules fermés et filtres en

place

Filtration et pressurisation en fonctionnement

Engins non dotés / Bâchés

96

Figure 12 : les différents niveaux de protection individuelle en images (52).

Les militaires français doivent être vaccinés contre la tuberculose, la diphtérie, le tétanos, la fièvre typhoïde, la poliomyélite, l’hépatite A. Ils sont également vaccinés contre la grippe, les méningocoques A et B, la fièvre jaune et contre le choléra lors de missions spécifiques. Leurs vaccinations sont vérifiées annuellement et avant chaque départ en mission. La vaccination contre la variole a été envisagée en cas de besoin, la plupart des militaires ont été vacciné une première fois en 1985.

Pour le charbon et la peste, l’antibiothérapie préventive à base de doxycycline est préférée à la vaccination. Pour la toxine botulique, la prévention consiste en la détection, mais surtout en une désinfection systématique de l’eau par filtration et chloration. Les militaires ont noté que la polyvaccination comporte des risques : lors de la première guerre du Golfe, le syndrome associé et développé par certains militaires, serait en partie attribué à des allergies à l’hydroxyde d’aluminium, adjuvant de nombreux vaccins.

La décontamination du matériel est efficace par aspersion de désinfectant comme de la soude ou de l’eau de Javel, les objets contaminés peuvent aussi être incinérés. La décontamination des hommes utilise le même principe avec des douches d’antiseptique : dans des enceintes, constituées par exemple de tentes, les hommes suivent une marche en avant depuis le secteur contaminé jusqu’au secteur sain (93).

97

3.3.1.1.3. Réseaux de surveillance

Au niveau national, pour les civils, des plans de surveillance ont été mis en place. En effet, tout cas de maladie suspecte ou d’épidémie dans la population doivent être signalés aux autorités sanitaires (Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales (DDASS), Institut de Veille Sanitaire (InVS), Cellule Interrégionale d’Epidémiologie d’Intervention (CIEI), Direction Générale de la Santé) par les médecins, les directeurs de laboratoire et les services de santé.

Certaines maladies sont des maladies à déclaration obligatoire pour l’Homme ; un formulaire est donc à retourner à la DDASS et l’information est gérée par l’InVS. Pour les animaux, certaines maladies, réputées contagieuses, entraînent une déclaration obligatoire à la Direction Départementale des Services Vétérinaires (DDSV) ainsi qu’une cascade de mesures de protection définies réglementairement. Ces systèmes de déclaration participent à la prévention et au maintien de la santé publique (93).

3.3.1.1.4. Le plan Biotox en France

buts et moyens :

Le plan Biotox date de 1990. Il se propose de définir les responsabilités pour les risques biologiques des différents Ministères : Intérieur, Santé, Défense. Il mentionne les mesures à prendre pour la prévention, la surveillance, l’alerte et les interventions.

La prévention consiste en la surveillance des lieux de stockage des produits biologiques à risque, des circuits de production, de détention et des contrôles de l’eau potable. L’alerte doit être donnée en cas de maladie suspecte aux autorités sanitaires : la DDASS et l’InVS. A cette fin, le plan comporte des fiches sur les principales maladies pouvant être utilisées comme arme microbiologique : la fièvre charbonneuse, la peste, la tularémie, la brucellose, les agents des fièvres hémorragiques, la variole et la toxine botulique.

Les laboratoires des hôpitaux doivent pouvoir traiter des prélèvements sans délai. Le SAMU a un protocole d’intervention. Des hôpitaux publics de référence ont été désignés : à Paris, il s’agit des hôpitaux de la Pitié-Salpêtrière, Bichat, Saint Antoine et Saint Louis ; en province, ce sont le CHU de Tourcoing, l’hôpital Charles Nicolle de Rouen, le CHU de Strasbourg, l’hôpital nord de Marseille, l’hôpital Pellegrin de Bordeaux, le CHU de Vandoeuvre les Nancy, l’hôpital Pontchaillou de Rennes, l’hôpital de la Croix Rousse de Lyon. Des formations portant sur les moyens d’isolement des malades et les traitements sont organisées pour le personnel des hôpitaux concernés. Le plan prévoit également de développer la recherche sur les vaccins et les traitements (93).

fiches thérapeutiques :

Les fiches du plan Biotox précisent la conduite à tenir face à une exposition à un agent microbiologique, comme la réception d’un colis ou d’une enveloppe suspects. Elles définissent le traitement à appliquer avec les posologies à employer.

En cas d’exposition à un aérosol, il faut envisager une décontamination par une douche avec des antiseptiques. En cas de contamination locale, il faut désinfecter la peau avec du Dakin.

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En cas de réception d’un paquet suspect (pas d’adresse d’expéditeur, provenance inconnue et inhabituelle, poudre, …), il ne faut pas l’ouvrir, mais contacter les autorités (pompiers, gendarmes). Si le paquet est ouvert, il faut le refermer, fermer la pièce où il se trouve et évacuer les personnes puis se laver les mains et contacter les autorités.

Les traitements proposés par les fiches du plan Biotox sont les suivants : l’administration par voie orale, pour un adulte, de ciprofloxacine à 500 mg, deux fois par jour ; ou bien de doxycycline à 100 mg, deux fois par jour, est préconisée après l’exposition en attendant l’identification de l’agent pathogène. Par voie parentérale, la ciprofloxacine est administrée en perfusions de 60 minutes toutes les 12 heures à la dose de 400 mg, et la doxycycline, en perfusions de 60 minutes, à 200 mg les premières 24 heures, puis à 100 mg toutes les 12 heures. Ces antibiotiques sont aussi indiqués dans le traitement de la fièvre charbonneuse, de la peste, de la tularémie. Pour la brucellose, la rifampicine est recommandée, à la dose de 600 à 1200 mg par jour en deux prises, associée à la doxycycline à 100 mg, deux fois par jour, pour un adulte. Pour la variole, le plan prévoit l’utilisation de la ribavirine, du cidofovir, de la pristinamycine ou de l’oxacilline. Cinq millions de doses de vaccin seraient disponibles (93).

Les problèmes majeurs liés à ces contre-mesures médicales sont la constitution de stocks suffisants, leur coût (par exemple, pour la ribavirine, un traitement classique de 15 jours revient à 915 €, et, sous forme d’aérosol, le flacon coûte 2 285 € et n’est disponible qu’aux Etats-Unis) et l’absence, la plupart du temps, d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) (52, 59).

les mesures sur le plan international :

Lors de la conférence d’Ottawa en novembre 2001 sur la sécurité de la santé et le bioterrorisme, les Ministres et les Secrétaires d’Etats de la Santé du Canada, de la France, de l’Allemagne, de l’Italie, du Japon, du Mexique, du Royaume Uni et des Etats-Unis, ainsi que le Commissaire de la Santé de l’Union Européenne, se sont mis d’accord pour prendre des mesures et pour renforcer la collaboration internationale.

Ils veulent instaurer une collaboration en matière de production de vaccins et d’antibiotiques, ainsi qu’en matière d’élaboration de méthodes d’analyse rapide. Ils préconisent d’appuyer l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) en ce qui concerne le réseau de surveillance des maladies, ainsi que la mise en commun des plans d’intervention face aux situations d’urgence. Ils recommandent une collaboration pour évaluer les risques et les gérer, pour renforcer les liens et les communications entre les laboratoires spécialisés comme ceux de niveau de biosécurité 4.

Ces accords ont été pris à la suite des évènements du 11 septembre 2001, mais depuis longtemps des mesures internationales ont été élaborées pour répondre à la menace microbiologique (93).

99

Dans le cadre général, les moyens techniques de contrôle d’une attaque biologique reposent sur les services de renseignements, de façon à pouvoir surveiller les pays et les groupes terroristes soupçonnés de posséder des armes biologiques, et sur les dispositifs de protection. Ceux-ci regroupent : - les moyens de détection : ils permettent de confirmer l’attaque, de délimiter la zone d’exposition et de prendre les mesures de protections adaptées. Différents appareils permettent la détection dans l’air, mais il ne faut pas négliger la surveillance de la faune, de la flore, des ressources alimentaires ainsi que le suivi épidémiologique des populations.

- les moyens de protection des armées : les armées disposent de tenues de combat NBC, de véhicules équipés de systèmes de filtration et de pressurisation. L’eau est filtrée et chlorée. Les personnes et le matériel exposés sont décontaminés. La vaccination des militaires est adaptée en fonction des missions mais, souvent, il n’existe pas de vaccin contre les agents utilisés en tant qu’arme biologique. En revanche, l’antibioprophylaxie est utilisable contre les agents bactériens.

- les réseaux de surveillance : en milieu civil, les plans de surveillance permettent l’information des autorités sanitaires lors de toute maladie suspecte. Plus spécifiquement, le plan biotox mentionne les mesures à prendre pour la prévention, la surveillance, l’alerte et les interventions en matière de risque biologique intentionnel. La surveillance concerne les lieux de stockage des produits biologiques à risque ainsi que les réseaux d’eau potable. Le plan regroupe les fiches d’information sur la conduite à tenir face aux principales maladies pouvant être utilisées comme arme biologique.

De plus, il a permis la mise en place d’une collaboration internationale en matière de production de vaccins, d’antibiotiques, de méthodes d’analyses rapides, etc …

3.3.1.2. Diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii (annexe 8)

Il n’existe, à l’heure actuelle, aucun système spécifique pour détecter Coxiella burnetii. Ceci s’explique sans doute par la faible probabilité de son utilisation dans un contexte purement militaire.

Dans le contexte d’une éventuelle attaque bioterroriste, le diagnostic se basera sur l’image clinique et épidémiologique dans un premier temps puis sur l’analyse sérologique car la fièvre Q se manifeste en général comme une maladie non différenciée ou comme une pneumonie atypique primaire. Il est donc difficile de la distinguer des pneumonies virales et des maladies provoquées par Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydia psittaci et Chlamydia pneumoniae. Certaines formes de pneumonies à Coxiella burnetii évoluant plus rapidement peuvent ressembler à des pneumonies bactériennes provoquées par la tularémie ou la peste. Les hépatites granulomateuses aiguë et chronique doivent être distinguées de l’hépatite tuberculeuse.

Afin de réaliser les examens sérologiques, il faut prélever des échantillons de sang : 5-10 mL au début de la maladie et après deux à trois semaines. Chaque prélèvement doit être refroidi et transporté aussi rapidement que possible dans de la glace. Il faut prendre des précautions pour éviter la contamination externe : mettre l’échantillon dans un sachet en plastique scellé avec la mention « risques élevés ». Mettre le sachet en plastique dans un deuxième emballage, prévoir un matériau absorbant de façon à éviter les fuites éventuelles.

100

Désinfecter l’emballage extérieur, par exemple, avec de l’hypochlorite à 0.1%. Mettre l’ensemble dans un troisième emballage. Chaque échantillon doit être emballé séparément (10).

Les mesures à prendre en cas de propagation intentionnelle de Coxiella burnetii (sous

forme d’aérosol) sont (10) : pour le patient : la plupart des patients se rétablissent totalement sans traitement après

quelques mois. Toutefois, les antibiotiques écourteront la durée de la maladie. La doxycycline est le meilleur traitement en cas de fièvre Q aiguë. La thérapie aux antibiotiques est la plus efficace lorsqu’elle est entamée durant les trois premiers jours de la maladie. La meilleure thérapie pour la fièvre Q aiguë est la doxycycline 100 mg deux fois par jour jusqu’à ce que le patient n’ait plus de fièvre pendant deux jours. Le traitement doit être répété en cas de rechute. Les quinolones présentent une bonne activité in vitro contre Coxiella burnetii et constituent une bonne alternative. Il n’est pas nécessaire d’isoler le patient. L’endocardite chronique due à la fièvre Q est plus difficile à traiter et requiert souvent l’utilisation de différents médicaments. Deux protocoles de traitement peuvent être utilisés :

doxycycline combinée avec des quinolones pendant au moins quatre années. doxycycline combinée avec l’hydroxycholoroquine pour un an et demi à trois ans.

Ce dernier schéma provoque moins de rechutes, mais nécessite un suivi régulier.

mesures de précaution pour le personnel hospitalier : se laver les mains, appliquer les mesures de précaution standard durant les

soins au patient. désinfection des expectorations, du sang et du matériel souillé par ces

substances, avec une solution contenant 0.05% d’hypochlorite, 1:100 de Lysol ou 5% de peroxyde.

antibiothérapie pour les personnes qui commencent à présenter des symptômes de la maladie.

mesures de précaution pour le personnel d’intervention (police, protection civile):

Dans le cas où l’on soupçonne une propagation à grande échelle de spores sous la forme d’aérosol, il convient de placer l’ensemble du personnel d’intervention sous observation régulière et de lui administrer des antibiotiques dès que des symptômes se manifestent.

pour les contacts:

La vaccination n’est pas nécessaire pour les contacts. Les personnes exposées doivent être surveillées et traitées si des symptômes apparaissent.

mesures administratives et de sécurité :

Chaque cas suspect doit être immédiatement signalé aux autorités sanitaires. L’étendue de la zone d’exposition doit être déterminée et décontaminée au moyen d’une solution de 0,05% d’hypochlorite ou de 1 : 100 de Lysol.

101

Concernant plus spécifiquement la diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii, il n’existe aucun système spécifique de détection. En cas d’attaque, le diagnostic serait basé sur l’allure clinique et épidémiologique dans un premier temps, puis sur les tests sérologiques.

Les mesures sanitaires et médicales recommandées sont : - pour le patient : antibiothérapie à base de doxycycline, 100 mg deux fois par jour. Le traitement est arrêté deux jours après la disparition de l’hyperthermie.

- pour le personnel hospitalier : mesures d’hygiène classiques, désinfection du matériel (à l’hypochlorite à 0,05%, au Lysol 1 :100 ou au péroxyde 5%), antibiothérapie si des symptômes apparaissent.

- pour le personnel d’intervention et les contacts : observation régulière et antibiothérapie si des symptômes apparaissent.

Quant aux mesures administratives, il convient de signaler tout cas aux autorités sanitaires, de déterminer la zone d’exposition et de la décontaminer (avec de l’hypochlorite 0,05% ou du Lysol 1 :100).

3.3.2. Les conventions de désarmement

Le désarmement est une préoccupation mondiale, les différents pays ont essayé de trouver des accords pour limiter la prolifération des armes microbiologiques mais la progression des accords est lente et difficile pour plusieurs raisons.

Les armes microbiologiques sont considérées par certaines puissances comme des armes d’utilité incertaine, leurs effets sont différés et sans garantie, donc ce domaine n’est pas une priorité. D’autre part, les pays qui en produisent ne veulent pas arrêter et ne sont donc pas favorables à des accords d’interdiction.

De plus, du point de vue diplomatique et politique, il y a des sujets plus importants à traiter comme celui du désarmement nucléaire. Par ailleurs, imposer un désarmement biologique pourrait créer des tensions diplomatiques qui gêneraient des accords dans d’autres domaines. Enfin, mettre l’accent sur les armes biologiques permet de détourner l’attention des armes chimiques (93).

3.3.2.1. Historique

Dès 1625, selon Meyrowitz, Grotius dans « De juri belli ac pacis » précise que le droit des gens interdit l’emploi de poison ou d’arme empoisonnée. Par contre, il est permis d’empoisonner les points d’eau avec des cadavres ou de la chaux. En 1866, le droit international codifié considère que l’emploi d’armes pouvant provoquer des maladies contagieuses est absolument interdit. La déclaration de Saint-Pétersbourg de 1868 précise que le but d’un Etat, lors d’un conflit armé, est d’affaiblir les forces armées de l’ennemi. L’emploi d’armes qui aggraveraient inutilement les souffrances des hommes mis hors de combat ou qui provoqueraient leur mort, en sous entendant l’emploi de maladie, est contraire aux lois de l’Humanité. En 1874, la conférence de Bruxelles a interdit l’emploi de poison ou d’armes empoisonnées, elle a été ratifiée par 43 pays. Elaboré lors de la conférence sur la limitation des armements, le Traité de Washington de 1922 interdit par un accord international les moyens de guerre chimique, et considère la propagation d’agents de maladie comme un moyen de guerre déloyal (93).

102

3.3.2.2. Le protocole de Genève de 1925

Le non emploi des armes biologiques a été formulé dans le protocole de Genève, reconnu par un grand nombre d’Etats. Il concerne également la prohibition de l’emploi de gaz asphyxiants, toxiques ou similaires. Il a été signé le 17 juin 1925 par 26 pays et est entré en vigueur le 8 février 1928. Les Etats ont adhéré au Protocole par des déclarations qui montraient leur accord ou leur soutien. Cependant, ce Protocole ne concerne ni la production, ni la préparation, ni la recherche, ni le transfert d’armes. Exemples de quelques pays ayant ratifié le protocole :

l’Allemagne, le 24 mai 1930 la Chine, le 24 août 1929 les Etats-Unis, le 10 avril 1975 la France, le 10 mai 1926 la Grande Bretagne, le 9 avril 1930 l’URSS, le 5 avril 1928 le Japon, le 21 mai 1970

La France, l’URSS et la Grande Bretagne ont assorti leur ratification ou leur adhésion de réserves. Les obligations du Protocole cesseront de plein droit, pour l’Etat réservataire, à l’égard de tout Etat ennemi dont les forces armées ou les alliés ne respecteraient pas les interdictions mentionnées par le Protocole et se serviraient d’armes biologiques. La réserve a, en fait, une action dissuasive.

Les Etats-Unis ont refusé, au départ, de signer le Protocole pour ne pas avoir d’engagement contraignant, à cause de la guerre froide. Par la suite, ils se sont engagés juridiquement lors du vote de la résolution de 1966 de l’Assemblée Générale des Nations Unies. Cette résolution a été acceptée en 1969 par 80 pays sans unanimité. Les Etats-Unis invitent alors tous les Etats à adhérer au Protocole, considérant que les armes de destruction massive représentent un danger pour l’Humanité et qu’il faut rechercher un accord en vue de l’arrêt de la mise au point et de la production d’armes chimiques et bactériologiques. Ils ont également condamné leur utilisation et ont demandé l’application de sanctions internationales contre ceux qui les utilisent.

Ainsi, les sanctions et les représailles sont régies par le droit de guerre, l’utilisation d’armes chimiques et bactériologiques étant alors assimilable à un crime de guerre. L’interdiction de la production des armes biologiques relève également du droit de guerre mais aussi du droit du désarmement.

La production est difficile à vérifier et le contrôle représente un abandon de souveraineté pour les Etats qui le subiraient. La recherche ne peut pas être interdite car elle est nécessaire au développement des moyens de protection, de prophylaxie et de traitement (93).

3.3.2.3. La Convention de Washington de 1972

La Convention de Washington sur l’interdiction de la mise au point, de la fabrication et du stockage des armes bactériologiques et des toxines et, sur leur destruction a été présentée à la 26ème Assemblée Générale des Nations Unies et ouverte à la signature le 10 avril 1972.

Elle se propose d’exclure des arsenaux militaires les armes de destruction massive utilisant des agents biologiques. Les Etats s’engagent ainsi à ne pas mettre au point, fabriquer, stocker, acquérir ou conserver :

103

- des agents bactériologiques ou biologiques en dehors de ceux destinés à des fins prophylactiques, de protection et d’autres fins pacifiques,

- les armes, les équipements ou les vecteurs destinés à l’emploi de ces agents.

Les Etats devront détruire ou convertir leur arsenal bactériologique neuf mois après l’entrée en vigueur de la Convention. Ils s’engagent à ne pas transférer leurs agents et leurs équipements à d’autres Etats ou organisations internationales. Ils peuvent déposer une plainte, avec des preuves, au Conseil de Sécurité de l’ONU, en cas de manquement à la Convention. Ils reconnaissent la nécessité de l’interdiction des armes chimiques. Les Etats s’engagent à coopérer et à faciliter les échanges scientifiques et techniques en vue de la prévention des maladies. Ils peuvent se retirer de la Convention avec un préavis de trois mois. Une conférence est alors prévue cinq ans après l’entrée en vigueur de la Convention, pour examiner son fonctionnement.

La Convention est entrée en vigueur le 26 mars 1975, 140 pays l’ont aujourd’hui ratifiée (c’est le cas de la Chine, des Etats-Unis, de la France, de l’Irak, de la Russie) et 18 l’ont signée.

La Convention autorise la recherche et la production d’agents biologiques pathogènes à des fins pacifiques, mais elle ne prévoit pas de système de contrôle et de vérification, qui permettrait de s’assurer que les objectifs sont bien respectés par les pays ayant un programme de recherches bactériologiques défensif.

En mars 1980, en septembre 1986, en septembre 1991 et en décembre 1996, se sont déroulées les conférences d’examen : elles ont mis sur pied des mesures pour renforcer les échanges de données sur les centres de recherche et les laboratoires, les programmes de recherche, la déclaration des installations impliquées dans les programmes et les connaissances sur les maladies. Elles demandent également la publication des connaissances et encouragent les visites et les échanges entre les scientifiques. Elles exigent la formulation des lois et règlements permettant d’appliquer la Convention, ainsi que la déclaration des anciens programmes et des installations qui travaillent sur les vaccins.

En 1992, un comité d’experts scientifiques et techniques a été créé : le VEREX. Il est chargé d’évaluer les mesures de vérification qui pourraient être prises dans le cadre de la Convention. Il se donne pour objectif de définir une liste des agents biologiques, des équipements et des activités qui devront rentrer dans les mesures de vérifications ; de mettre en place des mesures fiables, efficaces, raisonnables, confidentielles et qui n’interfèrent pas dans la sécurité des Etats, pour faire respecter la Convention.

En 1995, les signataires de la convention se sont mis d’accord pour négocier un protocole de vérification avec un système d’inspections. Les Etats n’ont cependant pas trouvé de terrain d’entente pour établir un protocole qui permettrait l’application de ce système. Les Etats-Unis ont imposé des clauses de sauvegarde pour minimiser les inspections : en effet, celles-ci sont limitées à des infrastructures militaires désignées par l’Etat inspecté. Pour que les vérifications soient efficaces, il faudrait inspecter régulièrement les installations militaires, l’ensemble des usines chimiques, pharmaceutiques, alimentaires et les infrastructures gouvernementales, ce qui est, bien entendu, inenvisageable car cela constitue une atteinte au droit de souveraineté des Etats (93).

104

3.3.2.4. Les contrôles de désarmement

En octobre 1990, après un accord entre les Etats-Unis, la Russie et la Grande Bretagne, des visites bilatérales de vérification ont été entreprises entre la Russie et les Etats-Unis. Une délégation de 15 personnes a visité quatre établissements proposés par l’institut Biopreparat, alors que celui-ci possédait 40 établissements dont 12 de recherche stratégique. Les Russes ont nié l’existence d’activités microbiologiques offensives. Les visites à Obolensk, au Vecteur de Koltsovo en Sibérie, à l’institut d’immunologie de Lioubitchoui, à l’institut de Leningrad étaient planifiées : certains laboratoires étaient écartés de la visite sous prétexte d’une quarantaine de 15 jours, et les activités militaires, sur les sites visités, avaient été abandonnées ou déménagées.

En décembre 1991, une délégation russe de 13 personnes, dont huit militaires, a visité les sites américains suspectés d’avoir des activités microbiologiques d’après des photos prises par des satellites espions. La délégation a visité à Camp Detrick un laboratoire de production de vaccin contre la fièvre charbonneuse ; près de Salt Lake City, une ancienne zone d’essai ; un ancien arsenal de munitions chimiques à Pine Bluff en Arkansas ; puis le Salk Center à Swiftwater, en Pennsylvanie, qui est un institut de recherche sur les vaccins.

Ces visites de vérification ne constituent que des engagements diplomatiques pour une meilleure entente entre les grandes puissances sur le sujet du désarmement.

Après la première guerre du Golfe en 1991, la Commission Spéciale de l’Organisation des Nations Unies (UNSCOM) a été créée pour surveiller et vérifier les activités bactériologiques et chimiques de l’Irak. Six sites appartenant au programme irakien d’armes biologiques ont été identifiés et démantelés. La dissimulation du programme a engendré une crise entre le gouvernement irakien et les Nations Unies. Cette crise a abouti, en 1998, à l’arrêt des inspections (93).

La cinquième conférence d’examen de la Convention a eu lieu à Genève en 2001. Un texte a alors été présenté pour renforcer les mesures de vérification. L’administration Bush a rejeté ce texte et la totalité du Protocole qu’elle considère comme inefficace et dangereux pour la sécurité américaine. Les Etats-Unis sont soupçonnés de cacher un programme de tests sur des agents non pathogènes à caractéristiques similaires aux agents utilisés pour la guerre bactériologique. Ils cacheraient un programme sur des bombes bactériologiques et sur des recherches génétiques concernant une souche résistante de fièvre charbonneuse. Tous ces éléments expliqueraient le changement de position des Américains à l’égard de la convention. Le gouvernement français a déclaré qu’il regrettait la position de Etats-Unis et qu’il soutenait les efforts entrepris en faveur d’un renforcement des mesures de la Convention (93).

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Figure 13 : accords internationaux mis en œuvre pour le désarmement microbiologique (93).

Protocole de Genève de 1925 Prohibition de l’emploi: - des gaz asphyxiants - des toxiques ou similaires - des moyens bactériologiques

Convention de Washington de 1972 Interdiction : - de la mise au point - de la fabrication - du stockage des armes bactériologiques

Destruction

Conférences d’examen Mars 1980 Septembre 1986 Septembre 1991 Décembre 1996 Juillet 2001 Mesures proposées sur : - les échanges scientifiques, - la déclaration des programmes anciens et pacifiques,

- les lois et les règlements permettant d’appliquer la Convention.

1992: création du VEREX, comité chargé d’établir des Mesures de vérification.

1. Autorisation de posséder des agents biologiques à des fins pacifiques 2. Destruction des armes en neuf mois 3. Pas de transmission des agents et des équipements 4. Coopération pour les échanges scientifiques 5. Plainte possible auprès du Conseil de Sécurité 6. Réunion cinq ans plus tard 7. Préavis de trois mois pour se retirer 8. Engagement par rapport au désarmement chimique

RESERVES

105

106

Le désarmement est une préoccupation mondiale depuis de nombreuses années mais la progression des accords est lente et difficile. En 1922, le traité de Washington considère que la propagation d’agents biologiques est déloyale. En 1925, le Protocole de Genève prohibe l’emploi des armes biologiques, il a été signé par 26 pays. En 1966, la résolution de L’Assemblée Générale des Nations Unies interdit la production et l’utilisation des armes biologiques. Elle prévoit également des sanctions en cas de non respect. Cette résolution a été signée par 80 pays.

Le texte clé dans cette lutte contre les armes biologiques a été prononcé en 1972, il s’agit de la Convention de Washington qui interdit la mise au point, la production et le stockage d’armes biologiques. Elle prévoit également la destruction des armes existantes. Aujourd’hui, 140 pays l’ont ratifiée. Différentes conférences d’examen ont eu lieu, par la suite ; elles ont permis la mise en place progressive de mesures de vérifications et de systèmes d’inspections.

La cinquième conférence d’examen a eu lieu en 2001, à Genève, où un texte a été présenté pour renforcer les mesures de vérification. Ce texte ainsi que la totalité de la Convention ont été rejetés par les Etats-Unis qui sont soupçonnés de cacher un programme concernant des bombes bactériologiques.

107

2ème partie : infection par aérosols sur

modèle murin : étude expérimentale

108

1. Objectifs

Le but de l’étude est d’identifier les effets biologiques induits chez la souris par des aérosols infectieux de Coxiella burnetii. Ces effets sont comparés sur deux modèles murins : un modèle normal et un modèle immunodéprimé, que l’on expose à deux souches différentes de Coxiella burnetii (la souche Nine Mile et la souche Q 212) et ce, à deux concentrations différentes (inoculum à 107 bactéries/mL et 108 bactéries/mL).

La présence de Coxiella burnetii dans l’aérosol est évaluée à l’aide d’un biocollecteur en phase liquide.

Les souris sont euthanasiées par lots de cinq, le jour de l’exposition, ainsi que sept et quatorze jours plus tard. Différents tissus sont alors prélevés.

La détection de Coxiella burnetii dans les prélèvements est réalisée par nested PCR. Les différents prélèvements font également l’objet d’analyses sérologiques, anatomopathologiques et immunohistochimiques.

Ainsi, le modèle expérimental proposé poursuit un double objectif : il contribue d’une part à l’étude de l’infection dans le cadre naturel et, d’autre part, à apporter des éléments de réponse concernant le risque et les effets d’une diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii.

2. Matériel et méthode 2.1. Installations et matériel utilisé

2.1.1. Souris

L’étude porte sur l’infection de 66 souris C57BL/6 et 66 souris SCID, mâles, de 5 semaines, provenant des laboratoires Charles River (L’Arbresle, France). Les souris SCID

sont immunodéficientes du fait d’une mutation autosomale récessive. Cette mutation entraîne un défaut de réarrangement des gènes codant pour les immunoglobulines et pour le récepteur T des lymphocytes T, ce qui les prive d’immunité acquise (la lignée lymphocytaire reste immature) et les rend hypersensibles aux radiations ionisantes (33, 69). Les C57BL/6 ont un statut immunitaire normal et sont peu sensibles à l’infection par Coxiella burnetii (19, 63, 133).

Figure 14: souris SCID mâles de 5 semaines.

Figure 15: souris C57BL/6 mâles de 5 semaines.

109

Seuls des mâles ont été retenus dans le cadre de ce protocole car les lésions observées sont plus marquées (105) que chez les femelles pour qui, les œstrogènes ont un rôle protecteur (70). Quant à l’âge, il a été déterminé en fonction de la taille de l’animal par rapport au dispositif expérimental.

A leur arrivée, les animaux sont mis en stabulation par groupes de dix, en séparant les deux types de souris. En ce qui concerne les souris SCID, des précautions particulières sont prises : les cages, la litière, l’alimentation et l’eau de boisson sont stérilisées au préalable. Toutes les cages, munies d’une cape filtrante, sont placées dans une enceinte close, en pression positive.

Figure 16: le dispositif d’hébergement des souris avant le début de l’étude. a. enceinte de stabulation. b. cage.

2.1.2. Souches de Coxiella burnetii

Deux souches ont été retenues dans le cadre de l’étude : la souche Nine Mile, souche de référence pour les formes aiguës, isolée chez une tique du Montana en 1935 (84), et la souche Q 212, souche de référence pour les formes chroniques, isolée en 1981 chez un patient de Nouvelle Ecosse souffrant d’endocardite (76, 114). Toutes deux sont fournies par le Centre National de Référence des Rickettsies (Marseille, France).

Chacune des deux souches est cultivée sur cellules L929 (fibroblastes murins) selon la méthode décrite en annexe 9 (70, 109) et diffusée par aérosols à deux concentrations : 107 bactéries/mL et 108 bactéries/mL.

2.1.3. Environnement

Compte tenu de la virulence de l’agent, l’étude se déroule en laboratoire de niveau de biosécurité 3, ce qui implique un certain nombre de contraintes en terme de protection individuelle, de procédure d’entrée dans le laboratoire et de dispositifs de sécurité pour l’environnement extérieur.

a

b

110

1er sas muni de sas

Douche

2ème sas

Autoclave

Caisson à aérosols

PSM de type II

Laboratoire utilisé pour les cultures

Laboratoire utilisé pour les aérosols.

Entrée du L3

Couloir de la zone L2

Caisson de stabulation

2.1.3.1. Tenue de protection

Elle comporte une combinaison jetable munie d’une capuche, deux paires de surchaussures jetables, portées l’une sur l’autre, un masque «bec de canard » à usage unique et deux paires de gants jetables portées l’une sur l’autre.

Figure 17: tenue de protection NSB 3 (Niveau de Sécurité Biologique 3).

2.1.3.2. Procédure d’entrée/sortie

Avant d’entrer dans le laboratoire, les manteaux, blouses de laboratoire et objets personnels doivent être déposés dans le vestiaire extérieur. La présence dans le L3 doit être signalée, en glissant une étiquette nominative sur le tableau prévu à cet effet à l’entrée du L3.

Le registre d’entrée sortie du L3 prévu à l’entrée doit être rempli : il comporte le nom de la personne entrant, les horaires d’entrée et de sortie, la nature de la manipulation effectuée à l’intérieur du L3.

Figure 18 : plan illustré du L3.

111

entrée dans le sas : ¤ première partie du sas :

On enfile la première paire de surchaussures, le masque et la première paire de gants, à usage unique puis on traverse la cabine de douche.

¤ deuxième partie du sas : On enfile la combinaison, la deuxième paire de surchaussures et la deuxième paire de gants.

entrée dans le laboratoire L3 :

Il faut veiller à refermer correctement la porte derrière soi. sortie du laboratoire L3 :

Les secondes paires de surchaussures et de gants sont enlevés dans le L3, avant de pénétrer dans le sas et sont jetés dans la poubelle sans en toucher l’intérieur.

sortie du sas :

¤ deuxième partie du sas : La combinaison est enlevée et jetée. On retire ensuite la première paire de surchaussures, le masque et la première paire de gants. Ils sont jetés dans la poubelle sans en toucher l’intérieur. Puis, on traverse la cabine de douche.

¤ première partie du sas : En sortant du sas, il faut veiller à ce que la porte soit correctement refermée. On replace l’étiquette afin de signaler son absence du L3 et on note l’horaire de sortie sur le registre.

2.1.3.3. Dispositifs de sécurité

étanchéité, traitement des effluents et dépression : afin d’empêcher toute fuite vers l’extérieur, les murs et le sol ont été conçus de façon étanche. L’air est extrait après passage sur un filtre Hépa. Tous les déchets sont stérilisés par autoclave avant d’être évacués. L’ambiance est en dépression permanente de -55 Pa dans le laboratoire et de -30 Pa dans les sas.

sécurité anti-effraction : L’accès dans le L3 est contrôlé au niveau de la porte d’entrée par un lecteur de badge relié à la centrale du poste de garde qui enregistre chaque mouvement. Seuls les badges des personnes autorisées donnent accès au L3. Les portes et fenêtres sont équipées de contacts anti-effraction dont la centrale est située dans le sas d’entrée n° 2. En fonctionnement normal cette alarme est désactivée.

sécurité technique des installations et des matériels : Les installations sont reliées à une centrale d’alarme technique implantée dans un lieu de passage, facilement accessible. Cette centrale reçoit toutes les alarmes des matériels sensibles: système de dépression, climatisation, congélateurs, fermenteurs, et détecteurs d’incendie. Elle est connectée au poste de garde de l’établissement.

112

2.1.4. Caisson à aérosols

Les aérosols sont réalisés à l’aide d’un caisson d’inhalation confiné de type NSB 3 (Niveau de Sécurité Biologique 3).

Figure 19: le caisson à aérosols. Ce caisson est composé de plusieurs éléments :

- un sas permettant d’introduire et de sortir les souris et le matériel en toute sécurité. - une boîte à gants, en dépression de -250 Pa par rapport au reste du laboratoire, dans

laquelle se trouve la chambre d’aérosolisation. - une chambre d’aérosolisation de 80 L, en dépression de -40 Pa par rapport à la boîte à

gants, dans laquelle est vaporisée la suspension bactérienne. Cette chambre comprend 16 emplacements où viennent s’insérer des modules pouvant contenir chacun trois souris maintenues dans un tube percé.

113

Figure 20: schéma du caisson à aérosols.

Figure 21: dispositifs de contention des souris. a. et b. mise en tube. c. module contenant trois souris

a b c

Sas de transfert

Incinérateur (350°C)

Air comprimé (12,5 L/min)

Diffusion d’aérosol bactérien en continu

Dépression : - 40 Pa

Dépression : - 250 Pa

Exposition des animaux Capacité de 48 souris

Module de filtration (modèle HEPA 14)

Nébuliseur de formol 2% permettant la décontamination du dispositif

Porte sur laquelle s’adapte le cylindre étanche

114

Les animaux sont ainsi disposés de façon à ce que seul leur museau soit en contact permanent avec l’aérosol.

Figure 22 : la chambre de vaporisation avec ses 16 emplacements prévus pour les animaux. a. vue de face. b. vue de profil avec les encoches permettant la fixation étanche des modules contenant les souris.

Deux injecteurs permettent de vaporiser la suspension bactérienne, contenue dans deux nébuliseurs distincts : un nébuliseur est un atomiseur qui permet de disperser uniquement des petites gouttes. L'air comprimé entre dans le nébuliseur par un orifice, l'air se détend à très grande vitesse dans le liquide. Il se crée alors un filament de liquide. Celui-ci est rompu en sortie du nébuliseur produisant ainsi des gouttelettes.

Le nébuliseur utilisé est de type Mini-Neb Inspiron (Ysebaert). Il permet de disperser des suspensions de microorganismes sans trop stresser ni affecter la viabilité des agents biologiques. Le générateur a un débit de 10 L/min sous une pression de 300 kPa et permet de disperser aisément des particules dont la taille est comprise entre 0,3 et 5 µm (74).

L’air extrait du caisson est décontaminé par passage sur filtre absolu et incinération à 400°C avant d’être rejeté à l’extérieur.

Figure 23: a. nébuliseur. b. extracteur permettant aux effluents d’être traités par filtration et incinération.

Le caisson est décontaminé par vaporisation de formol (Anios®) dans le sas, la boîte à gants et la chambre d’aérosolisation pendant deux heures, après chaque diffusion d’aérosol (74).

a b

arrivée d ’air comprimé

nébuliseur

a

injecteur

b

115

Des études préalables ont été réalisées afin de calibrer la durée des aérosols et la taille de l’inoculum nécessaire pour infecter des souris (74) :

effet du temps d’exposition sur la charge bactérienne pulmonaire à J0 :

l’étude a été réalisée sur cinq lots de six souris BALB/c exposées à un aérosol contenant Mycobacterium smegmatis concentré à 6.107 UFC/mL. Les souris sont exposées au même aérosol pendant des temps différents (25, 45, 75, 105 et 135 minutes) puis la charge bactérienne pulmonaire est mesurée deux heures après l’exposition. Après 25 minutes d’exposition, la charge est significativement plus faible que celle obtenue après 75, 105 et 135 min d’aérosol. Les temps d’exposition de 45, 75 et 105 min n’induisent pas de variation significative de la charge pulmonaire à J0 (annexe 10).

Ainsi, les souris doivent être exposées pendant au moins 45 min pour obtenir une charge pulmonaire suffisante mais il n’est pas utile, en terme de résultats, de les exposer plus longtemps.

effet de la taille de l’inoculum sur la charge bactérienne pulmonaire à J0 : l’étude a porté sur l’exposition, durant 45 min, de souris BALB/c à des aérosols contenant des concentrations croissantes de Mycobacterium smegmatis (104, 105, 106, 107, 108 et 109 UFC/mL). La charge bactérienne pulmonaire est mesurée deux heures après la fin de l’aérosol. La courbe obtenue (annexe 11) comporte trois phases : - pour des inoculums inférieurs à 105 UFC/mL, on se trouve à la limite de détection. - pour des inoculums compris entre 105 et 107 UFC/mL, la charge mesurée dans les poumons est inférieure à 104 UFC/poumon, ce qui correspond à la limite d’infection.

- pour des inoculums supérieurs à 107 UFC/mL, la charge pulmonaire est supérieure à 104 UFC/poumon sans dépasser 3.104 UFC/poumon (effet de saturation).

Par conséquent, la taille des inoculums doit être voisine de 5.107 bactéries/mL pour que les souris exposées soient infectées.

2.1.5. Biocollecteur en phase liquide : AGI 30 ou impinger

L'impinger est un échantillonneur biologique par impaction dans un milieu liquide, permettant de piéger les particules bactériennes émises au cours de l’aérosol : il comporte une pompe reliée à un dispositif en verre permettant « la capture » des bactéries. Lors du prélèvement les particules sont fortement accélérées (débit de prélèvement de 12,5 L/min) et vont s'impacter dans du liquide (ici, une solution de PBS (Phosphate Buffered Saline) permettant de conserver la viabilité des microorganismes).

Le prélèvement doit être réalisé lorsque la chambre d’aérosolisation est saturée et doit durer suffisamment longtemps pour obtenir une concentration détectable dans le liquide récolté. Ainsi, le prélèvement est effectué dix minutes après le début de l’aérosol et dure deux minutes (74).

116

Figure 24 : le biocollecteur en phase liquide. a. le dispositif de récolte avant sa mise en place dans le caisson. b. l’AGI 30 en place. c. prélèvement par impaction.

2.2. Déroulement de l’étude 2.2.1. Protocole général

L’expérimentation comprend cinq séries d’aérosols de 45 minutes :

- un aérosol témoin contenant de l’eau stérile sur un lot de douze souris (six C57BL/6 et six SCID).

- un aérosol (aérosol 1) contenant la souche Nine Mile à la concentration de 108 bactéries/mL sur un lot de 30 souris (15 C57BL/6 et 15 SCID).

- un aérosol (aérosol 2) contenant la souche Nine Mile à la concentration de 107 bactéries/mL sur un lot de 30 souris (15 C57BL/6 et 15 SCID).

- un aérosol (aérosol 3) contenant la souche Q212 à la concentration de 108 bactéries/mL sur un lot de 30 souris (15 C57BL/6 et 15 SCID).

- un aérosol (aérosol 4) contenant la souche Q212 à la concentration de 107 bactéries/mL sur un lot de 30 souris (15 C57BL/6 et 15 SCID).

Chaque aérosol est prélevé sur un biocollecteur en phase liquide (AGI 30) contenant 20

mL de Phosphate Buffered Saline (PBS). Le prélèvement est réalisé dix minutes après le début de l’aérosol pendant une durée de deux minutes.

Pour chaque série, cinq souris C57BL/6 et cinq souris SCID sont euthanasiées successivement (sauf pour l’aérosol témoin où l’on n’euthanasie que deux souris de chaque sorte) :

à J0, deux heures après la fin de l’aérosol. Le sang et les poumons sont prélevés. à J7 (septième jour post-exposition), on prélève le sang, le poumon, le cœur, le foie,

la rate et le cerveau. à J14 (quatorzième jour post-exposition), on prélève le sang, le poumon, le cœur, le

foie, la rate et le cerveau. Le sang et les prélèvements par impaction sont conservés à -80°C. Les autres

prélèvements sont conservés pour moitié à -80°C, l’autre moitié étant immergée dans du liquide de Bouin.

a b

c

117

Figure 25 : répartition des prélèvements dans le temps.

2.2.2. Déroulement des aérosols

Pour chaque aérosol, les souris sont placées dans un tube à extrémité percée. Les tubes sont rentrés dans la boîte à gants par le sas de transfert et sont chargés dans les modules, eux-mêmes mis en place dans leur logement sur la paroi verticale de la chambre d’aérosolisation.

La solution contenant l’inoculum est décongelée et répartie dans deux nébuliseurs, sous poste de sécurité microbiologique de type II (PSM II). Les deux nébuliseurs sont bouchés le temps de les introduire dans la boîte à gants par le sas de transfert. Ils sont ensuite reliés à leur injecteur respectif.

La vanne d’air comprimé est ouverte, après vérification de l’étanchéité du dispositif ; l’aérosol commence. A la dixième minute, le prélèvement sur biocollecteur en phase liquide est réalisé pendant deux minutes.

Au bout de 45 minutes, l’aérosol est terminé (la totalité de l’inoculum a été vaporisé) et les souris sont retirées des tubes dans la boîte à gants. Elles sont placées dans deux cages (rentrées au préalable dans l’enceinte) : dans la première cage sont placées les souris euthanasiées à J0. Ces souris sont transférées, via le sas, dans une nouvelle cage (celle-ci n’a

Prélèvements à J0: - sang - poumons


- cœur - foie - rate

- cerveau


- cœur - foie - rate

- cerveau

2 heures

7 jours

7 jours

Sacrifice de 5 SCID et de 5 C57/BL6



Prélèvement par impaction

Liquide de Bouin

Congélation à -80°C

Liquide de Bouin


Liquide de Bouin


Aérosol (45 minutes, 30 souris)

118

pas été en contact avec l’aérosol infectieux). Les souris peuvent ainsi être acheminées du caisson vers le PSM II. Le reste des souris est transféré en cylindre étanche vers le caisson de stabulation où elles sont placées à cinq par cages (en séparant les SCID des C57BL/6, et en séparant les souris euthanasiées à J7 de celles euthanasiées à J14). Chaque cage est couverte par une cape filtrante de façon à éviter les contaminations d’une cage à l’autre.

Figure 26: les dispositifs de transfert des souris. a. le sas de transfert utilisé pour les souris sacrifiées à J0. b. le cylindre utilisé pour le transfert des souris vers le caisson de stabulation.

2.2.3. Techniques de prélèvements

Les prélèvements sont réalisés sous PSM de type II. Chaque souris est anesthésiée au phosphate de pentobarbital dilué au dixième : 300 µL

sont injectés par voie intrapéritonéale. 0,5 à 1 mL de sang est prélevé par ponction intra-cardiaque à l’aide d’une aiguille de 25 Gauges montée sur une seringue de 1 mL. L’échantillon récolté est conservé à -80°C dans un tube contenant de l’EDTA comme anticoagulant.

Puis, on réalise l’euthanasie par dislocation cervicale. La souris est maintenue en décubitus dorsal par des aiguilles au niveau des quatre pattes,

on réalise une incision cutanée dans le plan sagittal à l’aide de ciseaux fins. Au niveau thoracique, deux incisions paramédianes sont réalisées de façon à retirer un

volet costal. Le cœur et les poumons sont prélevés.

Figure 27: fixation en croix d’une souris SCID et dissection du thorax en vue du prélèvement du cœur et des poumons.

a b

119

On réalise ensuite l’ouverture de la cavité abdominale par une incision musculaire dans le plan sagittal, de façon à prélever la rate et le foie.

La souris est ensuite placée en décubitus ventral. Une incision cutanée est réalisée dans le plan sagittal depuis la nuque jusqu’aux orbites. Les muscles du cou sont disséqués de façon à dégager la boîte crânienne. Deux incisions parasagittales sont effectuées sur le crâne à l’aide de ciseaux à iridectomie. Elles sont complétées par une incision osseuse dans le plan sagittal permettant ainsi de retirer deux volets osseux et de prélever l’encéphale en le dégageant de l’avant vers l’arrière.

Les organes sont coupés en deux fragments : le premier est placé dans une cassette à histologie et conservé dans du liquide de Bouin pour études anatomopathologique et immunohistochimique ; l’autre fragment est placé dans un cryotube et congelé à -80°C pour amplification génomique ultérieure.

2.2.4. Techniques d’analyses mises en œuvre

2.2.4.1. Sérologie (58, 70, 122)

La méthode utilisée, décrite en annexe 12, est une technique de sérologie par immunofluorescence indirecte semi-quantitative : des bactéries de phase I et II préalablement inactivées par du formaldéhyde à 0,1% sont déposées à la plume sur la moitié d’un spot d’une lame de verre (lames 18 spots, Dynatech). Les dépôts sont fixés dans un bain de méthanol. Chaque prélèvement de sang est décongelé puis dilué en cascade (dilutions de facteur deux, de 1/12,5 à 1/3 200) dans du PBS additionné de 3% de lait. Chacune de ces dilutions est déposée sur un spot. Après incubation en chambre humide, la présence du complexe antigène-anticorps est révélée par un anticorps de chèvre conjugué à de la fluorescéine (Beckman Coulter, Villepinte, France) et dirigé contre les immunoglobulines de souris.

La lecture est réalisée au microscope à fluorescence. Le titre de chaque prélèvement correspond à la dernière dilution pour laquelle on observe une fluorescence.

Figure 28: principe de la sérologie par immunofluorescence indirecte.

Coxiella burnetii (phase I ou II) inactivée au formaldéhyde 0,1%.

Anticorps anti-Coxiella burnetii (phase I ou II) présent dans l’échantillon à tester.

Anticorps secondaire (anticorps de chèvre) dirigé contre les anticorps de souris, lié à la fluoresceine.

fluorescence

Lumière fluorescente émise par le microscope.

120

2.2.4.2. Analyse anatomopathologique (72, 73)

Les poumons et les rates, fixés dans le liquide de Bouin, sont inclus en paraffine de façon à réaliser des coupes sériées de 3 µm d’épaisseur. Les lames sont ensuite colorées à l’hématoxyline-phloxine-safran (HPS). La lecture est réalisée au microscope optique.

2.2.4.3. Immunohistochimie (70, 71, 72)

Pour chaque organe, une deuxième série de lames est destinée à l’étude immunohistochimique. Celle-ci est effectuée après préparation des lames à l’aide d’un kit d’immunohistochimie (Histostain®-Plus, rabbit primary (AEC) ; Zymed Laboratories Inc., CliniSciences, Montrouge, France (annexe 13)) : après avoir déparaffiné les lames et réhydraté les coupes, l’anticorps spécifique (anticorps polyclonal anti-Coxiella burnetii de lapin dilué au 2 000ème) est appliqué. Sa fixation est révélée par un anticorps lié à de la biotine et dirigé contre les immunoglobulines de lapin. De la streptavidine liée à une péroxydase est ensuite mise en contact avec l’anticorps secondaire (la streptavidine a une forte affinité pour la biotine). Enfin, l’application d’Amino Ethyl Carbazole (AEC), chromogène et substrat de la péroxydase, permet de révéler le complexe antigène-anticorps. Une contre-coloration à l’hématoxyline de Mayer permet enfin d’améliorer le contraste de lecture.

Figure 29: principe du marquage de Coxiella burnetii par immunohistochimie.

Antigène de Coxiella burnetii.

Anticorps spécifique anti-Coxiella burnetii (anticorps de lapin).

Anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de lapin, lié à la biotine.

Streptavidine.Péroxydase. Amino Ethyl Carbazole (chromogène).

121

La lecture et le comptage des macrophages infectés par Coxiella burnetii sont réalisés au microscope optique.

Le nombre de macrophages infectés est ensuite rapporté à la surface de coupe observée. Cette mesure est effectuée à l’aide de l’analyseur d’image SAMBA 2005 (SAMBA Technologies, Grenoble, France) : chaque coupe est numérisée en 256 niveaux de gris. L’image obtenue a une résolution de 768 x 576 pixels (1 pixel = 40 µm). On réalise ensuite, sous contrôle visuel, un seuillage, c’est-à-dire la coloration numérique de la zone à mesurer puis le logiciel calcule la surface de cette zone.

Figure 30: mesure de la surface des coupes tissulaires par le logiciel SAMBA 2005. a. numérisation de la coupe. b. seuillage et calcul de la surface.

2.2.4.4. Analyse statistique

Le nombre moyen de macrophages immunomarqués par unité de surface est comparé, pour chaque lot, en utilisant le test non paramétrique de Mann-Whitney. Le test est significatif lorsque P < 0,05.

2.2.4.5. Détection par LCN (Light Cycler nested PCR) (46, 58, 123, 132, 136)

La détection de Coxiella burnetii est réalisée sur les prélèvements par impaction en phase liquide réalisés en cours d’aérosol, sur les poumons et sur le sang. Dans la mesure où une PCR simple a une sensibilité de détection de l’ADN bactérien insuffisante sur les prélèvements sanguins (136), on réalise une nested PCR. Elle fait intervenir deux couples d’amorces, ce qui permet d’amplifier deux séquences d’ADN, une séquence externe et une séquence interne située entre le couple d’amorces externes. On augmente ainsi la sensibilité de la détection par rapport à une PCR simple.

a

b

122

Figure 31: principe de la nested PCR (dNTP : oligonucléotides (ATP, TTP, CTP, GTP)).

Avant de réaliser la nested PCR sensu stricto, il faut d’abord extraire l’ADN à partir des différents prélèvements à étudier. On réalise également cette opération pour les différents inoculum qui serviront de témoins positifs (de l’extraction, de la réaction de PCR et de la séparation par électrophorèse).

2.2.4.5.1. Extraction de l’ADN

Les différentes étapes, décrites en annexe 14, suivent les recommandations du fabricant du kit utilisé (QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN S.A., Courtaboeuf, France)) : après une étape de digestion tissulaire et/ou une étape de digestion cellulaire aboutissant à la libération des différents constituants de la cellule, l’ADN est purifié par des lavages successifs et récupéré par élution.

2.2.4.5.2. Amplification génomique par nested PCR

L’appareil utilisé, le Light Cycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne) associe à la fois un thermocycler et un micro-spectrofluorimètre reliés à un ordinateur. Cet appareil a été développé afin de réaliser une PCR quantitative en temps réel : une molécule fluorescente (le SYBR Green, Roche Diagnostics, Meylan, France) est intercalée toutes les 20 paires de bases lors de la phase d’élongation de l’ADN. Le signal fluorescent qu’elle émet est donc directement proportionnel à la concentration d’ADN durant la phase exponentielle de l’élongation. Cet appareil a été employé, dans notre étude, pour des raisons différentes : premièrement, il permet de diminuer la durée des cycles dans la mesure où l’on travaille sur de petits volumes, deuxièmement, la sensibilité est meilleure (58,1% contre 18,6% pour une

Dénaturation de l’ADN et hybridation des amorces externes.

Ajout des dNTP, de la Taq polymérase et élongation du fragment externe.

Dénaturation de l’ADN et hybridation des amorces internes.

Elongation du fragment interne.

Fragment externe. Fragment interne. Amorces externes.Amorces internes.

123

nested PCR classique) et troisièmement, il permet de réaliser une « one step nested PCR » lors de laquelle les deux couples d’amorces sont mélangés aux autres réactifs dès le début de la réaction, ce qui limite les contaminations et augmente ainsi la spécificité de la technique (136).

Figure 32: le Light Cycler. On amplifie une séquence incluse dans l’unique gène de la superoxyde dismutase trouvé

chez Coxiella burnetii. Ce gène est situé sur le chromosome bactérien et comporte 1026 paires de bases (pb) (11, 132).

On utilise pour cela deux couples d’amorces (Sod 1 et 2, Eurogentec France, Angers, France) dont les séquences sont présentées en annexe 15. Le couple d’amorces externes (Sod 1) permet l’amplification d’une séquence de 286 pb. Les amorces internes (Sod 2) amplifient une séquence de 104 pb située entre les amorces externes (annexe 15). Les autres réactifs proviennent d’un kit (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I®, Roche Diagnostics, Meylan, France) qui contient la Thermus aquaticus polymérase (Taq polymérase « Hot Start »), les oligonucléotides (dNTP), du chlorure de magnésium (MgCl2) et de l’eau. Le mélange de ces réactifs, auxquels on ajoute les amorces et de la sérumalbumine bovine (BSA) est décrit en annexe 16. Ce mélange est réalisé dans une pièce dédiée à cet effet où aucun échantillon d’ADN ne doit entrer, pour éviter toute contamination. Il est ensuite réparti dans des capillaires en verre disposés dans une boîte réfrigérée (la réfrigération inhibe l’hybridation des amorces entre elles ainsi que l’activité de la Taq polymérase).

Figure 33: a. pièce dédiée au mélange des réactifs. b. boîte réfrigérée contenant les capillaires de verre.

a

b

124

La boîte est ensuite emmenée dans une autre pièce où l’on ajoute, dans chaque capillaire, 2 µL de l’ADN à amplifier. Les capillaires sont bouchés au fur et à mesure, puis centrifugés et placés dans le carrousel de l’appareil.

Figure 34: mise en place des capillaires. a. dans le carrousel. b. puis dans le Light Cycler. Le Light Cycler a une capacité de 32 capillaires, ce qui permet de tester 29 échantillons,

un témoin « eau » (témoin négatif permettant de vérifier que les échantillons n’ont pas été contaminés au moment de leur dépôt dans les capillaires), un témoin négatif de l’extraction d’ADN (souris exposée à l’aérosol témoin) et un témoin positif (inoculum utilisé pour les aérosols).

La réaction de nested PCR proprement dite comporte quatre étapes : une étape de dénaturation initiale de 8 s à 95°C (vitesse de transition de 20°C/s) qui permet la séparation des deux brins d’ADN ainsi que l’activation de la Taq polymérase ; une première étape d’amplification (amplification du fragment externe) de 35 cycles. Chaque cycle est décomposé en :

une dénaturation de 15 s à 95°C. une hybridation des amorces externes de 8 s à 56°C. une élongation de 12 s à 72°C, température optimale pour activer l’enzyme.

La troisième étape (réamplification) permet l’amplification du fragment interne, elle comporte également 35 cycles décomposés de la même manière si ce n’est que la phase d’hybridation ne dure que 5 s à 50°C et l’élongation 10 s à 72°C. A la fin du dernier cycle, l’appareil réalise une dénaturation lente (30 s) jusqu’à 95°C permettant une ultime séparation des brins d’ADN amplifiés.

Tableau XIII : les différentes phases de la nested PCR.

Etape Phase Température Durée Evènements Dénaturation

initiale 95°C 8 s Séparation des brins d’ADN. Activation de la Taq polymérase.

dénaturation 95°C 15 s Séparation des brins amplifiés au cycle précédent.

hybridation 56°C 8 s Hybridation des amorces externes (%G+C = 36,84)

Amplification

(35 cycles) élongation 72°C 12 s Synthèse du fragment externe

dénaturation 95°C 15 s Séparation des brins amplifiés au cycle précédent.

hybridation 50°C 5 s Hybridation des amorces internes(%G+C = 45)

Réamplification (35 cycles)

élongation 72°C 10 s Synthèse du fragment externe.

Dénaturation lente 95°C 30s Séparation des derniers brins amplifiés.

a b

125

La température d’hybridation dépend de la taille des amorces et est inversement proportionnelle au pourcentage de guanine et de cytosine qui compose leur séquence (%G+C) : en effet, plus le %G+C est élevé, moins la température donc l’énergie nécessaire pour l’hybridation est importante. Ainsi, cela permet d’amplifier principalement la séquence externe lors de la phase d’amplification, puis la séquence interne lors de la réamplification, tout en mélangeant dès le début de la réaction les deux couples d’amorces.

Après la phase de dénaturation lente, les produits de la réaction sont récupérés et séparés par électrophorèse dans la mesure où le Light Cycler ne peut interpréter les résultats de nested PCR (136).

2.2.4.5.3. Séparation des séquences amplifiées par électrophorèse (annexe 17)

Les produits de la réaction de PCR sont séparés sur gel d’agarose à 2% additionné de bromure d’éthydium (BET) : l’agarose forme un maillage au travers duquel l’ADN migre sous l’effet du courant électrique, ce qui permet de séparer les fragments en fonction de leur poids moléculaire. Ce maillage doit être d’autant plus étroit (concentration en agarose élevée) que les fragments à séparer sont de petite taille. Le pouvoir résolutif de ce type de gel est de dix à 20 pb au maximum (dans notre cas, on obtient une résolution à 50 pb près). Le bromure d’éthydium ajouté lors de la préparation du gel va permettre de révéler la séparation car cette substance, qui s’illumine lorsqu’on l’expose aux rayons ultraviolets (UV) et qui migre en sens inverse de l’ADN (les charges électriques des deux molécules sont opposées), s’intercale entre les bases de ce dernier.

Chaque échantillon est déposé au fond d’un des puits du gel : pour visualiser ce dépôt, l’échantillon est mélangé avec du bleu de bromophénol auquel on ajoute du glycérol qui, du fait de son poids élevé, entraîne l’échantillon au fond du puits. Comme étalon, on dépose, à chaque extrémité du gel, un marqueur de poids moléculaire (marqueur VI, Roche Diagnostics, Meylan, France).

Le contact électrique est obtenu en immergeant le gel dans un tampon de triborate d’EDTA (TBE) à 0,5 volume. La migration dure 30 min avec un courant de 135V.

Figure 35: a. poids moléculaire des différentes bandes du marqueur VI. b et c. séparation des produits de PCR sur gels d’agarose. b. après le dépôt. c. en cours de migration.

b

c

a

126

La lecture se fait par illumination aux ultraviolets. Le fragment attendu (104 pb), s’il est présent, migre à la hauteur de la dernière bande du marqueur (154 pb).

Figure 36: interprétation des gels après migration et illumination aux ultraviolets. échantillons contenant la séquence interne amplifiée par PCR.

3. Résultats 3.1. Lésions macroscopiques

Nomenclature :

- aérosol 1 : souche Nine Mile à 108 bactéries/mL. - aérosol 2 : souche Nine Mile à 107 bactéries/mL. - aérosol 3 : souche Q212 à 108 bactéries/mL. - aérosol 4 : souche Q212 à 107 bactéries/mL. Macroscopiquement, à J0, aucune lésion n’est observée. A J7, on observe des lésions pulmonaires de type inflammatoire chez les souris SCID des

aérosols 1 et 2, 3, 4 (les lésions les plus marquées étant observées sur les aérosols 1 et 2). Quelques lésions hépatiques sous forme de zones décolorées apparaissent chez les souris SCID de l’aérosol 1 (et de l’aérosol 2 dans une moindre mesure).

A J14, on n’observe plus de lésion pulmonaire chez les souris SCID, par contre, on note une splénomégalie marquée chez les souris SCID des aérosols 1 et 3. Chez les souris

Marqueur de poids moléculaire

Témoin positif migrant au niveau de la bande de 154 pb du marqueur.

Témoins négatifs (eau et souris témoin) de la réaction de PCR.

127

C57BL/6, on observe le même type de lésions pulmonaires que sur les souris SCID à J7 mais de façon plus modérée et uniquement chez les souris C57BL/6 exposées aux aérosols 1 et 2. Une splénomégalie moins marquée est également notée chez les souris C57BL/6 des aérosols 1 et 3.

D’autre part, une autolyse précoce du cerveau est constatée à J14, sur les deux souches murines des aérosols 1, 2, 3 et 4, et ce de façon très marquée sur l’aérosol 1.

Tableau XIV: récapitulatif des lésions macroscopiques observées lors du prélèvement des organes.

poumons

foie

rate

cerveau

SCID 0 J0 C57/BL6 0

SCID Plages

inflammatoires (1, 2, 3 et 4)

Plages décolorées (1, 2)

0

0 J7

C57/BL6 0 0 0 0

SCID 0 0 Splénomégalie

marquée (1, 2, 3, 4)

Autolyse précoce (1, 2, 3, 4) J14

C57/BL6

Plages inflammatoires

(1, 2) 0 Splénomégalie

modérée (1, 3) Autolyse précoce

(1, 2, 3, 4)

3.2. Résultats de la détection par Light Cycler nested PCR 3.2.1. Détection de Coxiella burnetii dans l’aérosol

La présence de Coxiella burnetii a été mise en évidence dans chaque prélèvement par impaction en milieu liquide.

128

3.2.2. Détection dans les poumons

Les résultats de la détection figurent dans le tableau XV.

Tableau XV : résultats de la détection par LCN* de Coxiella burnetii dans les poumons.

Type d’aérosol Jour de sacrifice Type de souris

Nombre de souris chez lesquelles Coxiella burnetii a été mise en

évidence/nombre de souris testées

SCID 5/5 J0 C57BL/6 5/5

SCID 5/5 J7 C57BL/6 5/5 SCID 5/5

Souche Nine Mile à 108

bactéries/mL J14 C57BL/6 5/5 SCID 2/5 J0

C57BL/6 2/5 SCID 1/5

J7 C57BL/6 0/5 SCID 0/5



C57BL/6 1/5 SCID 1/5 J7 C57BL/6 1/5 SCID 0/5

Souche Q212 à 108 bactéries/mL

J14 C57BL/6 0/5

SCID 0/5 J0 C57BL/6 1/5

SCID 1/5 J7 C57BL/6 0/5 SCID 0/5


J14 C57BL/6 0/5

SCID 0/2 J0 C57BL/6 0/2

SCID 0/2 J7 C57BL/6 0/2

SCID 0/2

Aérosol témoin

J14 C57BL/6 0/2 *LCN : Light Cycler Nested PCR.

Coxiella burnetii est ainsi principalement détectée dans les poumons des souris exposées à la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL et sacrifiées à J0, J7 et J14. En ce qui concerne l’aérosol contenant Nine Mile, concentré à 107 bactéries/mL, on ne détecte la bactérie que chez quelques souris (de chaque type) sacrifiées à J0.

Quant aux aérosols contenant la souche Q212, on ne détecte la bactérie que chez quelques souris (SCID et C57BL/6) exposées à la concentration la plus élevée (108 bactéries/mL) et sacrifiées à J0 et J7.

129

3.2.3. Détection dans le sang Les résultats de la détection figurent dans le tableau XVI.

Tableau XVI : résultats de la détection par LCN* de Coxiella burnetii dans le sang.

Type d’aérosol Jour de sacrifice Type de souris

Nombre de souris chez lesquelles Coxiella burnetii a été mise en

évidence/nombre de souris testées

SCID 0/5 J0 C57BL/6 1/5 SCID 4/5 J7 C57BL/6 3/5 SCID 5/5








J14 C57BL/6 0/5 SCID 1/5 J0



J14 C57BL/6 0/5 SCID 0/2 J0


Aérosol témoin

J14 C57BL/6 0/2 *LCN : Light Cycler Nested PCR.

Coxiella burnetii est ainsi principalement détectée dans le sang des souris exposées aux

deux aérosols concentrés à 108 bactéries/mL. Pour la souche Nine Mile, on observe une bactériémie chez toutes les souris sacrifiées à

J7 ainsi que chez les souris SCID sacrifiées à J14. En ce qui concerne la souche Q212, on détecte principalement la bactérie dans le sang des deux types de souris sacrifiées à J7.

130

3.3. Résultats de l’analyse sérologique

La présence d’anticorps anti-Coxiella burnetii n’est détectée que chez un seul lot de souris : il s’agit des cinq C57BL/6 exposées à la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL (aérosol 1) et sacrifiées à J14. Chez ces cinq souris, on détecte à la fois des anticorps anti-phase I et anti-phase II et ce, à un titre de 1/1600.

3.4. Résultats des analyses anatomopathologiques et immunohistochimiques

Deux types d’organes ont été analysés : les poumons et les rates des souris sacrifiées à J7 ainsi qu’à J14.

3.4.1. Lésions anatomopathologiques

3.4.1.1. Lésions pulmonaires Les lésions pulmonaires sont des lésions inflammatoires avec, principalement, une infiltration macrophagique formant des granulomes inflammatoires dans les parois interstitielles pulmonaires. Ces lésions sont retrouvées à la fois chez les souris SCID et C57BL/6 exposées à la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL (aérosol 1) et ce, chez les souris sacrifiées à J7 et à J14 (l’intensité des lésions étant plus marquée à J7). En ce qui concerne les autres aérosols, aucune lésion pulmonaire n’est constatée à l’analyse anatomopathologique.

Figure 37: lésions pulmonaires visibles à J7. a. chez les souris SCID. b. chez les souris C57BL/6. (coloration Hématoxyline-Phloxine-Safran, grossissement x 400). macrophage.

Figure 38: poumon normal (souris témoin) (coloration Hématoxyline-Phloxine-Safran, grossissement x 400).

a b

131

3.4.1.2. Lésions spléniques L’analyse des coupes de rate montre l’absence de granulome inflammatoire (lésion habituellement retrouvée lors d’infections à Coxiella burnetii inoculée par voie intrapéritonéale (24)).

Figure 39: coupes de rate (coloration HPS). a. chez une souris C57BL/6 à J14 : absence de granulome inflammatoire (grossissement x 200).b. Granulome splénique typiquement rencontré lors de fièvre Q aiguë (grossissement x 250) (67).

3.4.2. Résultats de l’analyse immunohistochimique

3.4.2.1. Analyses réalisées sur les poumons

La présence de macrophages immunomarqués est constatée sur les coupes de poumons des souris SCID et C57BL/6 exposées à la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL (aérosol 1) et sacrifiées à J7 et à J14.

Figure 40: macrophages immunomarqués contenant Coxiella burnetii dans leurs phagolysosomes. Lésions visibles sur les coupes réalisées à J7. a. chez les souris SCID ( macrophage alvéolaire infecté par Coxiella burnetii). b. chez les souris C57BL/6 (grossissement x 400).

a b

a b

132

Le nombre de macrophages immunomarqués a été compté sur l’ensemble de chaque coupe et la surface de celle-ci a été mesurée. La moyenne et l’écart-type du rapport ainsi obtenu figurent dans le tableau XVII.

Tableau XVII : moyennes et écarts-type du nombre de macrophages immunomarqués par mm2 comptés chez les souris exposées à l’aérosol 1 et sacrifiées à J7 et J14.

Jour de sacrifice

Type de souris

Nombre moyen de macrophages immunopositifs par mm2 Ecart-type

SCID 5,7 1,7 J7 C57BL/6 3,1 1

SCID 1,9 0,7 J14

C57BL/6 0,2 0,1

La comparaison de ces différentes moyennes par le test non paramétrique de Mann-

Whitney montre qu’il n’y a pas de différence significative entre les différents lots.

3.4.2.2. Analyses réalisées sur les rates

Les seuls immunoréactivités mises en évidence concernent les souris SCID exposées à la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL (aérosol 1) et sacrifiées à J14 : il s’agit d’une immunoréactivité localisée à la paroi de quelques capillaires sinusoïdes spléniques et dans quelques macrophages de la pulpe blanche.

Figure 41: immunohistochimie réalisée sur les coupes de rate des souris exposées à aérosol 1 et sacrifiées à J14. a. chez une souris SCID : macrophage immunomarqué ; immunoréactivité de la paroi d’un capillaire sinusoïde. b. chez une souris C57BL/6 : absence de marquage.(grossissement x 400).

a b

133

3.5. Récapitulatifs des résultats Tableau XVIII : récapitulatif des différents résultats obtenus.

Lésion anatomopathologiques

LCN

sang* Titre en

anticorps LCN

Poumon*poumon rate

Nombre de macrophages pulmonaires immunoréactifs par mm2

SCID 0/5 0 5/5 J0 C57BL/6 1/5 0 5/5 SCID 4/5 0 5/5 ++ - 5,7±1,7 J7

C57BL/6 3/5 0 5/5 ++ - 3,1±1 SCID 5/5 0 5/5 + + 1,9±0,7 A

éros

ol 1

: N

ine

Mile

108

J14 C57BL/6 1/5 1/1600 5/5 + - 0,2±0,1

SCID 1/5 0 2/5 J0 C57BL/6 1/5 0 2/5

SCID 0/5 0 1/5 - - 0 J7 C57BL/6 0/5 0 0/5 - - 0

SCID 0/5 0 0/5 - - 0 Aér

osol

2 :

Nin

e M

ile 1

07

J14 C57BL/6 1/5 0 0/5 - - 0

SCID 1/5 0 2/5 J0 C57BL/6 1/5 0 1/5

SCID 3/5 0 1/5 - - 0 J7 C57BL/6 2/5 0 1/5 - - 0

SCID 0/5 0 0/5 - - 0 Aér

osol

3 :

Q21

2 10

8

J14 C57BL/6 0/5 0 0/5 - - 0

SCID 1/5 0 0/5 J0 C57BL/6 0/5 0 1/5

SCID 0/5 0 1/5 - - 0 J7 C57BL/6 0/5 0 0/5 - - 0

SCID 0/5 0 0/5 - - 0 Aér

osol

4 :

Q21

2 10

7

J14 C57BL/6 0/5 0 0/5 - - 0

SCID 0/2 0 0/2 J0 C57BL/6 0/2 0 0/2

SCID 0/2 0 0/2 - - 0 J7 C57BL/6 0/2 0 0/2 - - 0

SCID 0/2 0 0/2 - - 0

Aér

osol

tém

oin

J14 C57BL/6 0/2 0 0/2 - - 0

* nombre de souris chez lesquelles Coxiella burnetii a été détectée par Light Cycler Nested PCR.

134

4. Discussion

Comme cela a été présenté dans la première partie de ce travail, la fièvre Q humaine peut se présenter sous une forme aiguë ou sous une forme chronique. La forme aiguë, contractée principalement par voie respiratoire ou digestive (23, 128), peut se manifester sous différentes formes cliniques dont les plus courantes sont : un syndrome fébrile isolé, une pneumonie ou une hépatite granulomateuse. La fréquence de ces formes est très variable selon la zone géographique. Par ailleurs, les souches de Coxiella burnetii isolées chez les patients souffrant de formes aiguë ou chronique présentent une hétérogénéité importante (7, 55). De plus, la mise en évidence de formes chroniques chez des patients immunodéprimés a prouvé que le terrain de l’hôte était un facteur important à prendre en compte (61, 107).

Ainsi, dans une étude précédente (81), un modèle expérimental animal a été élaboré afin d’étudier l’influence de ces paramètres sur l’expression clinique de la maladie : des souris immunocompétentes (souris BALB/c) ont été infectées avec différentes souches de Coxiella burnetii ( la souche MPZ, isolée à partir d’un placenta humain, la souche NSCI, isolée à partir d’un utérus de chatte, la souche Q229, isolée chez un patient souffrant d’endocardite et la souche Nine Mile en phase I et en phase II, isolée chez une tique de l’espèce Dermacentor andersoni). Deux voies d’inoculation ont été utilisées : la voie intrapéritonéale et la voie intranasale. Aucune différence n’a été mise en évidence quant au pouvoir pathogène des différentes souches étudiées. En revanche, ce modèle expérimental a permis de montrer que l’infection par voie intrapéritonéale se manifeste par une hépatosplénomégalie associée à une pneumonie interstitielle alors que par voie intranasale on n’observe qu’une pneumonie interstitielle. Cette étude démontre ainsi que la voie d’infection détermine la forme clinique de fièvre Q aiguë (81).

Cependant, ce modèle reproduit l’infection par voie respiratoire par des instillations intranasales, ce qui ne correspond pas tout à fait aux conditions de l’infection naturelle qui se contracte par l’inhalation d’aérosols infectieux (115, 117). Nous avons donc tenté d’améliorer la reproduction de ces conditions d’infection naturelle en utilisant un dispositif capable de produire des aérosols contenant Coxiella burnetii.

D’autre part, la première partie de ce travail a également montré que Coxiella burnetii est un agent pathogène à prendre en compte, en matière de risque biologique provoqué intentionnel et notamment dans le cadre du bioterrorisme, du fait de sa grande résistance dans le milieu extérieur (20, 88, 134), de son pouvoir infectieux chez l’Homme (21, 93), de sa voie d’infection principalement respiratoire associée à la possibilité d’une dissémination par aérosols (128), de ses effets incapacitants (10), de son diagnostic souvent difficile (111) et de son traitement contraignant (48).

Ainsi, le modèle expérimental présenté ici contribue non seulement à l’étude de l’infection dans le cadre naturel mais apporte également des éléments de réponse concernant le risque et les effets d’une diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii.

135

4.1. Le dispositif expérimental

Le premier résultat d’intérêt que nous pouvons dégager de cette étude concerne le dispositif expérimental : le caisson que nous avons utilisé pour générer les aérosols infectieux a été développé et calibré pour l’étude de bactéries intracellulaires facultatives (étude de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium smegmatis en particulier) (74). Nous ne disposions d’aucune donnée sur les aérosols infectieux générés par ce type de dispositif concernant des agents pathogènes intracellulaires obligatoires. Nous avons donc été obligé d’extrapoler pour Coxiella burnetii, les résultats obtenus avec Mycobacterium smegmatis notamment en ce qui concerne la taille de l’inoculum à utiliser et la durée d’exposition des souris à l’aérosol, ceci avec le risque de n’obtenir aucun résultat exploitable. Cela n’a pas été le cas puisque nos résultats démontrent qu’il est possible d’infecter des souris avec Coxiella burnetii en utilisant ce type de matériel.

Cette extrapolation soulève, en revanche, des interrogations : les souris de notre modèle ont bien été infectées avec le protocole utilisé mais il convient de se demander si l’on obtiendrait les mêmes résultats, notamment en matière de lésions anatomopathologiques, en faisant varier les paramètres physiques de l’aérosol (débit d’air comprimé, taille des particules, durée d’exposition, par exemple). De plus, les aérosols infectieux générés par ce dispositif sont des aérosols statiques. De même, ils ont été produits à partir d’une suspension de bactéries purifiées en laboratoire. Autant de paramètres qui ne correspondent pas vraiment aux conditions naturelles dans la mesure où interviennent plutôt des poussières contaminées, disséminées par les vents (38).

4.2. L’infection par aérosols

Ensuite, nos résultats montrent que, sous certaines conditions que nous détaillerons par la suite, l’exposition de souris à un aérosol contenant Coxiella burnetii entraîne bien l’infection de celles-ci : la présence de la bactérie est détectée dans les poumons deux heures après l’exposition et y persiste jusqu’à 14 jours (détection positive par nested PCR et par immunohistochimie), entraînant le développement de lésions inflammatoires caractérisées par une infiltration interstitielle de macrophages principalement. L’observation de ce type de lésions confirme ce qui avait été constaté sur le modèle d’infection par voie intranasale (81) : l’inoculation de Coxiella burnetii par voie respiratoire entraîne une pneumonie interstitielle.

En revanche, dans notre modèle, cette infection locale, qui engendre une réponse immunitaire non spécifique, peut se propager et devenir systémique : on observe une bactériémie à partir du septième jour post-exposition ; celle-ci étant plus ou moins persistante au quatorzième jour. Cette infection systémique provoque ainsi une réponse immunitaire spécifique dont le témoin est l’apparition d’anticorps anti-Coxiella burnetii de phase I et II à partir du quatorzième jour post-exposition et ce, à un titre significatif (45, 70, 77) chez les souris C57BL/6 uniquement puisque les souris SCID, du fait de la mutation génétique qu’elles portent, sont dépourvues de toute réponse immunitaire acquise (les lymphocytes demeurant immatures) (33, 69).

Ces résultats affinent ainsi ceux précédemment obtenus lors d’infection par voie intranasale (81) : en effet, dans le précédent modèle, la réponse anticorps était indétectable chez les souris infectées par voie intranasale et sacrifiées au bout de dix jours (titre < 1/8). De plus, chez les souris infectées par voie intranasale, aucun microorganisme n’était visible dans les poumons (au dixième jour post-infection), ce qui tendait à montrer qu’au niveau

136

pulmonaire, la clearance de Coxiella burnetii est plus rapide en comparaison de celle observée au niveau hépatique. Nos résultats obligent donc à nuancer cette conclusion puisque notre modèle d’aérosols permet, d’une part, d’induire une infection locale persistante au quatorzième jour (lésions inflammatoires associées à la présence de Coxiella burnetii dans les macrophages pulmonaires) et une infection systémique à partir du quatorzième jour (persistance de la bactériémie associée à l’apparition de la réponse anticorps). Ceci est également conforté par l’observation chez certaines souris (souris SCID exposées à l’aérosol contenant la souche Nine Mile à 108 bactéries/mL et sacrifiées 14 jours après l’infection) de lésions spléniques que l’on peut qualifier de « pré-lésions » granulomateuses fréquemment observées au quatrième jour après une infection par voie intrapéritonéale (67).

Concernant les résultats sérologiques, les souris de notre modèle développent à la fois des anticorps anti-phase I et des anticorps anti-phase II (titre identique dans les deux cas de 1/1600), ce qui est assez surprenant dans la mesure où, habituellement, une infection aiguë entraîne l’apparition d’anticorps anti-phase II uniquement (45, 77, 81).

Ainsi, notre modèle d’infection par aérosols permet-il de voir apparaître, chez la souris, à la fois les signes d’une infection locale plus ou moins persistante dans le temps ainsi que ceux d’une infection systémique.

4.3. Influence de la taille de l’inoculum

La taille de l’inoculum nécessaire pour provoquer une telle d’infection est très supérieure aux inoculum utilisés, d’une part, lors d’infection par voie intranasale (106 bactéries (81)) et, d’autre part, lors d’infection par voie intrapéritonéale (5.105 (70), 106 (81) à 3,85. 106 (19) bactéries). De plus, dans notre modèle, l’infection est fortement dose-dépendante avec une transition brutale : à 107 bactéries/mL, Coxiella burnetii est quasiment indétectable dans les poumons et ce, même deux heures après l’exposition d’où une absence totale de lésion anatomopathologique. Cela sous-entend que, dans les conditions naturelles, l’aérosol inhalé doit être très concentré en bactéries pour être infectieux.

Cependant, cette conclusion soulève une question quant à la pertinence du modèle animal utilisé : d’une part, rapporté au poids de l’animal, la taille de l’inoculum ne correspond pas du tout aux doses infectieuses reconnues chez l’Homme, chez qui une seule bactérie peut suffire à provoquer l’infection (2, 93). D’autre part, l’espèce murine est reconnue pour être peu sensible à l’infection (63). Cependant, la souris demeure un des modèles les plus couramment employés en expérimentation animale, en général (du fait de sa taille et de son métabolisme rapide, notamment), et dans le cadre de la recherche sur la fièvre Q en particulier, ce qui permet de comparer les résultats des différentes études.

D’autre part, dans la mesure où les deux concentrations que nous avons utilisées encadrent la concentration minimale infectieuse, il serait sans doute intéressant de voir les effets d’une concentration supérieure comme cela a été réalisé sur le cobaye (67) chez qui, il a été démontré que la taille de l’inoculum (correspondant à une surexposition à l’agent pathogène) avait une influence sur le type de lésions observées. En effet, comme cela est constaté lors de fièvre Q aiguë humaine, des lésions de myocardite ont été observées chez les animaux exposés aux inoculum les plus concentrés (67, 105).

137

4.4. Influence de la souche de Coxiella burnetii Notre étude expérimentale fait également intervenir deux souches de Coxiella burnetii : la

souche Nine Mile qui est la souche de référence pour les formes aiguës de fièvre Q. C’est aussi la souche la plus utilisée dans les études menées sur la fièvre Q et la plus ancienne puisqu’elle a été isolée en 1935 chez une tique (Dermacentor andersoni) dans le Montana (76, 78, 83, 84). La deuxième souche que nous avons utilisée est la souche Q212, il s’agit de la souche de référence pour les formes chroniques de fièvre Q, elle a été isolée chez un patient de Nouvelle Ecosse souffrant d’endocardite, en 1981 (76, 78, 114). Le tableau XIX récapitule les caractéristiques des ces deux souches.

Tableau XIX : caractéristiques des souches Nine Mile et Q212 (76, 78, 83, 84, 114, 119, 124).

Souche Provenance géographique Source Année de

découverte Groupe

génomique Type de plasmide

Effet cytopathique (annexe 18)

Forme clinique

Nine Mile

Hamilton (Montana) Tique 1935 I QpH1

petites cellules rondes,

phagolysosome de petite taille

aiguë

Q212 Nouvelle Ecosse

Valve cardiaque 1981 V QpRS*

Grosses cellules,

phagolysosome aussi gros que

la cellule

chronique

* la souche Q212 est en fait dépourvue de plasmide mais elle intègre, dans le chromosome bactérien, la séquence du plasmide QpRS (83).

De nombreuses études ont tenté de montrer que la souche de Coxiella burnetii, et, notamment le type de plasmide qu’elle héberge, déterminait la forme clinique de la maladie. Cependant, la controverse demeure (76, 81, 118, 125). C’est dans ce contexte que nous avons choisi les deux souches présentées ici, afin d’apporter des éléments de réponse quant à l’existence de cette relation entre différences génétiques de l’agent pathogène et aspects cliniques de la maladie. Nos résultats montrent que le pouvoir pathogène des deux souches étudiées semble être différent chez la souris. En effet, la souche Nine Mile, diffusée à 108 bactéries/mL, entraîne une infection locale persistante ainsi qu’une une infection systémique chez toutes les souris alors que la souche Q212, diffusée à la même concentration, n’engendre aucune lésion anatomopathologique, n’est détectée que chez quelques souris, dans les poumons et le sang au septième jour post-exposition et est totalement éliminée au quatorzième jour post-exposition. Ceci tendrait donc à prouver que les souches et donc les différences génétiques existant entre celles-ci sont un facteur déterminant quant à la forme clinique de la maladie.

Cependant, nos résultats doivent être nuancés. D’une part, nous n’avons testé que deux souches alors qu’il en existe un grand nombre : si le catalogue de l’American Type Culture Collection n’en propose que sept (76), le Centre National de Référence pour l’Etude des Rickettsies, à Marseille, en possède environ 150. Aussi, faudrait-il étoffer notre modèle expérimental en testant d’autres souches hébergeant le plasmide QpRS ou sa séquence, comme la souche Priscilla, par exemple. Cette souche étant, de plus, une souche d’origine

138

animale (isolée à partir du placenta d’une chèvre ayant avorté dans le Montana en 1980 (76)), peut-être observerait-on une différence de pouvoir pathogène chez la souris, par rapport à Q212, isolée chez l’Homme.

Ensuite, les passages répétés en cultures cellulaires entraînent une diminution de la virulence chez Coxiella burnetii (76). Si les bases biochimiques de ce phénomène demeurent encore inconnues, celui-ci pourrait interférer avec les résultats que nous interprétons comme un effet lié à la souche.

Enfin, les méthodes utilisées pour dénombrer les bactéries intracellulaires obligatoires comportent également des incertitudes. Nous disposions de deux techniques pour titrer nos inoculum : le dénombrement sur coloration de Gimenez (51, 70, 81) et le titrage par immunofluorescence (67, 109). Le dénombrement sur coloration de Gimenez consiste à compter au microscope le nombre de bactéries présentes sur cinq champs pris au hasard ; la moyenne de ce décompte, rapportée à la surface totale, permet d’évaluer la concentration de l’inoculum préparé. Cette technique est donc peu précise et ne permet pas de contrôler ni la viabilité des bactéries ni leur virulence (elle ne discrimine pas les bactéries de phase I de celles de phase II). La deuxième méthode de titrage, qui est celle que nous avons utilisée, repose sur l’immunofluorescence indirecte (67, 109) : on dilue en série l’inoculum préparé puis on infecte une monocouche de cellules avec chaque dilution. Après six jours d’incubation, les cellules infectées sont révélées par immunofluorescence (selon le même principe que celui de la sérologie par immunofluorescence indirecte (figure 18)). Le nombre de bactéries présentes dans l’inoculum est ainsi calculé à partir de la dernière dilution pour laquelle on observe au moins une cellule infectée. Cette technique permet donc de contrôler la viabilité des bactéries et de discriminer les bactéries de phase I de celles de phase II. Cependant, le dénombrement reste approximatif dans la mesure où il est évalué à un facteur de dilution près.

Aussi, faut-il être prudent quant à la comparaison des résultats obtenus avec les deux souches de Coxiella burnetii, dans la mesure où un effet de dose pourrait interférer avec une éventuelle différence de virulence liée à la souche.

4.5. Influence du sexe

En matière de fièvre Q humaine, le sex ratio est très inégal, les formes cliniques étant observées plus fréquemment chez les hommes que chez les femmes (24). De même, chez la souris, l’infection est plus sévère chez les mâles que chez les femelles (105). Ce sont ces deux constatations qui ont motivé le choix du sexe de l’hôte dans notre étude. Cependant, il aurait été sans doute pertinent de pouvoir comparer les effets liés au sexe avec notre dispositif expérimental.

4.6. Influence de l’immunocompétence

Nous avons inclus dans notre étude un modèle de souris immunodéprimées : il s’agit de souris portant une mutation autosomale récessive qui entraîne un défaut de réarrangement des gènes codant pour les immunoglobulines et pour le récepteur T des lymphocytes du même nom (l’épissage des gènes V(D)J ne peut se faire). Ces souris sont ainsi dépourvues de toute immunité acquise (33, 69).

Dans le cadre de l’infection naturelle, l’immunodépression est, chez l’animal, un facteur de réceptivité crucial (36, 80, 105, 116, 122). De même, de nombreuses études menées chez l’Homme, ont montré que le statut immunitaire de l’hôte jouait un rôle majeur, non seulement dans l’apparition d’une fièvre Q chronique (104, 105, 106, 107) mais également

139

dans l’expression clinique de la forme aiguë, les patients immunodéprimés présentant plus fréquemment une pneumonie (108).

Cependant, dans notre étude, l’état immunitaire du sujet exposé ne semble influer ni sur la réceptivité vis-à-vis de Coxiella burnetii ni sur la nature anatomopathologique des lésions pulmonaires. Quant à l’intensité de ces lésions, les résultats obtenus ne permettent pas de conclure à une différence significative entre les souris C57BL/6 et les souris SCID.

En revanche, on observe tout de même une tendance à l’augmentation des réponses locale et systémique chez les souris SCID : bien que les résultats obtenus ne soient pas statistiquement significatifs, les macrophages pulmonaires semblent plus permissifs à Coxiella burnetii. D’autre part, la bactériémie plus persistante, est associée à un début de lésions spléniques. Cette tendance aurait pu être confirmée ou infirmée en augmentant la taille des différents lots et en réalisant des séries de prélèvements à des temps plus tardifs (21, 28 voire 35 jours post-exposition), ce qui n’a pas été envisagé au départ pour deux raisons, principalement : d’une part, les souris SCID étant très fragiles, nous aurions sans doute eu une mortalité importante au-delà de J14, et ce, sans savoir si cette mortalité était liée au seul stress de la captivité ou à l’infection par Coxiella burnetii. D’autre part, il a été démontré précédemment que les lésions observées chez la souris atteignaient leur intensité maximale 14 jours, au plus tard, après l’infection expérimentale (90).

De plus, le modèle SCID n’est peut-être pas le modèle le mieux adapté pour l’étude de la fièvre Q aiguë contractée par aérosols : nous avions préféré ce modèle au modèle d’immunodépression induite par le cyclophosphamide (Endoxan®, injection intrapéritonéale de 200mg/kg, trois jours avant l’infection (62)) pour des raisons pragmatiques certes, mais surtout car cela permettait, d’une part, d’avoir des lots les plus homogènes possibles et, d’autre part, cela limitait le risque de mortalité des souris avant le début de l’étude.

4.7. Perspectives 4.7.1. Coxiella burnetii et le risque biologique naturel

Le modèle expérimental d’infection par aérosols présenté dans ce travail permet de

compléter les études sur la fièvre Q aiguë menées jusqu’ici par voie intranasale. Il permet d’ores et déjà de montrer que la diffusion de Coxiella burnetii sous forme d’aérosols entraîne, chez la souris, une infection locale sous la forme d’une pneumonie interstitielle puis une infection systémique.

L’observation de cette infection est néanmoins fortement dépendante de la dose infectante et nécessite, de plus, un inoculum beaucoup plus concentré que ceux utilisés lors d’infections expérimentales par voie intrapéritonéale (au moins 108 bactéries/mL).

D’autre part, il semble que la souche de Coxiella burnetii diffusée dans l’aérosol ait une influence sur l’apparition de l’infection chez la souris.

Enfin, le statut immunitaire de l’hôte ne semble pas avoir d’influence sur l’infection ni sur la nature des lésions observées chez la souris, du moins dans les 14 jours qui suivent l’exposition à l’aérosol.

Cependant, notre travail s’est limité à l’analyse du sang, des poumons et des rates. Or, la

fièvre Q aiguë se manifeste également, chez l’Homme, par des céphalées, voire des méningo-encéphalites, des hépatites, et peut se compliquer par des endocardites principalement voire des myocardites (45, 105). C’est donc dans la perspective de l’étude ultérieure de ces différentes formes que nous avons également prélevé le cerveau, le foie et le cœur des souris que nous avons sacrifiées.

140

De plus, ce travail n’est qu’un préliminaire dans la mesure où différents points restent perfectibles.

En ce qui concerne le dispositif expérimental, il serait intéressant de calibrer le caisson plus spécifiquement pour les bactéries intracellulaires obligatoires et notamment pour Coxiella burnetii. D’autre part, un nouveau protocole d’infections murines pourrait bénéficier des études complémentaires actuellement en cours sur les caractéristiques physiques de l’aérosol généré par le caisson (taille des particules, répartition de celles-ci dans l’espace et dans le temps notamment).

Quant à l’inoculum, différents points seraient à améliorer : d’une part, le titrage devrait être plus rigoureux de façon à pouvoir étudier les effets liés à la souche de Coxiella burnetii sans avoir d’interférence avec un effet lié à la taille de l’inoculum. Une nouvelle méthode de dénombrement, associant à la fois une amplification de l’ADN de Coxiella burnetii par PCR et une quantification basée sur le principe ELISA, a d’ailleurs été décrite en 1995 et semble donner des résultats fiables (48). Ensuite, les effets de la taille de l’inoculum pourraient être étudiés en exposant des souris à des aérosols de concentrations croissantes à partir de 108 bactéries/mL, ce qui permettrait d’évaluer les effets liés à une surexposition. De même, on pourrait affiner la reproduction des conditions naturelles de l’infection en diffusant une suspension de poussières contaminées par Coxiella burnetii.

Il faudrait également inclure dans le modèle expérimental un plus grand nombre de souches afin de pouvoir vraiment conclure à un effet déterminant de celles-ci en matière de fièvre Q aiguë contractée par voie respiratoire. On pourrait utiliser, à cette fin, d’autres souches isolées chez des patients souffrant d’endocardite telles que les souches Q228 ou Q216 par exemple ou encore des souches isolées chez des patients atteints de forme aiguë (comme la souche Henzerling ou Dyer RSA345) (76). Il serait également pertinent d’étudier, au sein de ces souches associées à une fièvre Q aiguë, des isolats issus de patients souffrant d’hépatite, de pneumonie et même de patientes ayant avorté, afin de voir si l’on obtient le même tableau lésionnel ou non, notamment au niveau pulmonaire. De même, il faudrait étudier des souches isolées chez l’animal (souches Priscilla ou Idaho Goat par exemple) (76). Ce n’est qu’au terme de ces travaux qu’il sera possible de conclure à un effet de la souche sur la forme clinique de fièvre Q aiguë.

Concernant l’étude des facteurs favorisants liés à l’hôte, les travaux ultérieurs incluront sans doute des femelles, dans la mesure où une partie de celles-ci pourraient être gravides et permettraient, de surcroît, d’étudier un autre modèle d’immunodépression et de compléter, dans ce domaine, les résultats précédemment obtenus sur des souris gestantes (122). D’autres modèles d’immunodépression pourront également approfondir notre travail : les souris pourraient, par exemple, être préalablement traitées au cyclophosphamide ou au corticoïdes ou encore exposées à des rayons X (131). Bien sûr, compte tenu des résultats que nous avons obtenus, les différentes séries de prélèvements seront poursuivies pendant plusieurs semaines.

4.7.2. Coxiella burnetii et le risque provoqué intentionnel

A propos de l’utilisation de Coxiella burnetii à des fins bioterroristes, de nombreuses questions restent en suspens.

En effet, lors de la préparation de notre protocole expérimental, nous avons constaté qu’il n’était pas si simple de se procurer des souches de Coxiella burnetii : en effet, il faut les commander à l’American Type Culture Collection (ATCC), ce qui n’est, bien sûr, pas à la portée de tout le monde. Ensuite, l’ATCC ne propose que sept souches et celles-ci semblent relativement homogènes dans la mesure où elles possèdent toutes le plasmide QpH1 (76).

141

On peut alors avoir recours à une source naturelle à condition de se déplacer dans une zone d’enzootie mais il se pose alors le problème de la multiplication des bactéries : pour notre étude, la production des 4,5.109 bactéries dont nous avions besoin a nécessité le travail à temps plein d’un technicien expérimenté pendant plusieurs semaines. De plus, il faut pouvoir disposer du matériel et des systèmes cellulaires adaptés et, d’autre part, avoir accès à un laboratoire de niveau de biosécurité 3, au sein duquel, le travail comporte les contraintes de sécurité que nous avons présentées lors de la description des installations utilisées dans le cadre de notre étude.

Ensuite, durant les 14 jours qui ont suivi l’infection des souris par aérosols, nous n’avons pas observé de mortalité ni même de signe clinique liés à l’infection, contrairement à d’autres études (81, 122). Même si l’Homme est reconnu comme étant plus sensible que la souris à l’infection par Coxiella burnetii (2, 63, 93), cette constatation peut, dans une certaine mesure, soulever le doute quant à l’infectiosité de cet agent pathogène.

Ainsi, pour être efficace en terme de bioterrorisme, il faudrait disposer d’une souche présentant une virulence maximale pour un inoculum le plus petit possible. Aussi, faut-il peut-être nuancer le risque bioterroriste lié à Coxiella burnetii même si notre modèle d’aérosols n’est qu’un modèle expérimental animal qui ne permet pas, avec certitude, de connaître les effets engendrés par la dispersion grandeur nature de Coxiella burnetii.

142

CONCLUSION

Décrite pour la première fois en 1935, en Australie, la fièvre Q est aujourd’hui une zoonose répandue dans le monde entier bien que son incidence ainsi que l’importance des carnivores domestiques comme sources de l’infection humaine soient encore sous estimées. Le danger inhérent à son agent causal, Coxiella burnetii, est, pour l’Homme, grave voire mortel, le diagnostic étant, de plus, difficile, le traitement contraignant et les moyens prophylactiques limités.

Par ailleurs, à l’aube du XXIème siècle, la nouvelle donne géopolitique et géostratégique mondiale incite les gouvernements à prendre en compte le risque biologique provoqué et notamment la menace bioterroriste ; la liste des agents pathogènes utilisables, dont Coxiella burnetii fait partie, étant de surcroît longue et les moyens de défense limités.

Ce double contexte nous a donc amené à élaborer un modèle expérimental d’aérosols permettant, pour la première fois, d’approcher les conditions naturelles d’infection ainsi que les conditions les plus probables de diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii afin d’en évaluer les effets biologiques sur l’espèce murine.

Ainsi, l’exposition, durant 45 minutes, à des aérosols contenant deux souches de Coxiella burnetii (Nine Mile et Q212), à deux concentrations différentes (107 et 108 bactéries/mL), de deux types murins (dont l’un est immunodéprimé), sacrifiés à une semaine d’intervalle pendant deux semaines, a provoqué une infection, d’abord locale (pneumonie interstitielle) puis systémique. L’apparition d’une telle infection est cependant fortement dose-dépendante et nécessite un inoculum très concentré. La souche de Coxiella burnetii pourrait également être un facteur conditionnant l’apparition de l’infection chez la souris. En revanche, le statut immunitaire de l’hôte ne semble pas avoir de conséquence statistiquement significative dans les 14 premiers jours de l’infection.

Néanmoins, ces résultats seraient à compléter par des études ultérieures : le dispositif expérimental serait ainsi calibré spécifiquement pour Coxiella burnetii, un inoculum plus concentré permettrait d’évaluer les effets d’une surexposition (dans un cadre de diffusion intentionnelle par exemple), l’étude d’autres souches de bactéries permettrait de confirmer l’importance de ce facteur comme déterminant de la forme clinique de la maladie. Enfin, d’autres modèles d’immunodépression, étudiés sur des temps plus longs permettraient de confirmer l’importance du terrain de l’hôte lors d’infection contractée par voie respiratoire.

Enfin, dans le cadre du risque biologique provoqué, nous avons pu constater les difficultés pour acquérir et produire une grande quantité de bactéries. De plus, les résultats que nous obtenons soulèvent des questions quant à l’infectiosité de l’agent. Ainsi, faut-il peut-être nuancer le risque lié à la diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii même si rien ne peut être affirmé à partir de notre seul modèle expérimental animal.

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154

ANNEXES

155

Annexe 1 : coloration de Macchiavello (91) Fixer rapidement à la chaleur (jamais à l'alcool) un frottis préparé depuis moins de 24 heures. Recouvrir la lame d'une solution de fuchsine basique à 0,25%. Laisser agir cinq minutes. Laver à l'eau distillée neutre. Différencier à l'acide citrique à 0,50% de telle manière qu'il ne reste que quelques fragments rouges sur le frottis et que la teinte générale de la préparation soit rose. Rincer à l'eau. Recolorer rapidement au bleu de méthylène à 1% et rincer à l'eau. Le frottis doit avoir une teinte lilas. Coxiella burnetii apparaît en rouge sur un fond bleu. (15)

Annexe 2: coloration de Stamp (91) Fixer les frottis à la chaleur. Recouvrir la lame de fuchsine phéniquée de Ziehl diluée au 1/5ème en eau distillée (préparation extemporanée). Laisser agir dix minutes. Laver à l'eau et différencier à l'acide acétique en solution aqueuse à 3‰ durant environ deux secondes. Rincer et recolorer au bleu de méthylène en solution aqueuse à 1% durant deux à trois secondes. Rincer. Coxiella burnetii apparaît en rouge sur un fond bleu.

Annexe 3: coloration de Gimenez (121)

Fixer les frottis à la chaleur. Recouvrir la lame durant deux minutes avec une solution de carbol fuchsine diluée et filtrée. Rincer abondamment à l'eau. Recouvrir la lame de vert malachite durant neuf secondes. Rincer à l'eau, laisser sécher. Coxiella burnetii apparaît en rouge sur un fond vert.

Carbol fuchsine : dissoudre 10 g de fuchsine dans 100 mL d'éthanol à 95 ; mettre 11,25 g de phénol dans 250 mL d'eau à 37 °C ; mélanger ces deux solutions dans 650 mL d'eau. Ce colorant se conserve un an à température ambiante.

Solution de carbol fuchsine diluée : mélanger 2 mL de carbol fuchsine et 5 mL de tampon [mélanger 3,5 mL de NaH2PO4 (0,2 mol/L), 15,5 mL de Na2HPO4 (0,2 mol/L) et 19 mL d'eau]. La solution diluée se conserve 48 heures.

Vert malachite : dissoudre 2 mg d'oxalate de malachite à 0,8% dans 250 mL d'eau. La solution se conserve à température ambiante durant quatre mois.

156

Annexe 4: maladies des listes A et B de l’OIE (5)

Liste A : Maladies transmissibles qui ont un grand pouvoir de diffusion et une gravité particulière, susceptible de s'étendre au-delà des frontières nationales, dont les conséquences socio-économiques ou sanitaires sont graves et dont l'incidence sur le commerce international des animaux et des produits d'origine animale est très importante. Les rapports concernant ces maladies sont adressés à l'OIE avec une périodicité conforme aux dispositions des articles 1.1.3.2 et 1.1.3.3 du Code zoosanitaire international.

• Fièvre aphteuse • Maladie vésiculeuse du porc • Peste des petits ruminants • Dermatose nodulaire

contagieuse • Fièvre catarrhale du mouton • Peste équine • Peste porcine classique • Maladie de Newcastle

• Stomatite vésiculeuse • Peste bovine • Péripneumonie contagieuse bovine • Fièvre de la Vallée du Rift • Clavelée et variole caprine • Peste porcine africaine • Influenza aviaire hautement

pathogène

Liste B : Maladies transmissibles qui sont considérées comme importantes du point de vue socio-économique et/ou sanitaire au niveau national et dont les effets sur le commerce international des animaux et des produits d'origine animale ne sont pas négligeables. Ces maladies font généralement l'objet d'un rapport annuel, mais dans certains cas, selon la périodicité prévue par les dispositions des articles 1.1.3.2 et 1.1.3.3 du Code zoosanitaire international, elles peuvent faire l'objet de rapports plus fréquents. Maladies communes à plusieurs espèces

• Cowdriose • Echinococcose/hydatidose • Fièvre charbonneuse • Fièvre Q • Leptospirose • Maladie d Aujeszky • Myiase à Chrysomya bezziana • Myiase à Cochliomyia hominivorax • Paratuberculose • Rage • Trichinellose

Maladies des bovins • Anaplasmose bovine • Babésiose bovine • Brucellose bovine • Campylobactériose génitale bovine • Coryza gangreneux • Cysticercose bovine • Dermatophilose • Encéphalopathie spongiforme bovine • Leucose bovine enzootique • Rhinotrachéite infectieuse

bovine/vulvovaginite pustuleuse infectieuse

• Septicémie hémorragique • Theilériose • Trichomonose • Trypanosomose (transmise par tsé-tsé) • Tuberculose bovine

157

Maladies des ovins et des caprins • Adénomatose pulmonaire ovine • Agalaxie contagieuse • Arthrite/encéphalite caprine • Avortement enzootique des brebis (chlamydiose ovine)

• Brucellose caprine et ovine (non due à B. ovis)

• Epididymite ovine (Brucella ovis) • Maedi-visna • Maladie de Nairobi • Pleuropneumonie contagieuse caprine • Salmonellose (S. abortusovis) • Tremblante

Maladies des équidés • Anémie infectieuse des équidés • Artérite virale équine • Dourine • Encéphalite japonaise • Encéphalomyélite équine de l'Est ou de l'Ouest • Encéphalomyélite équine vénézuélienne • Gale des équidés • Grippe équine • Lymphangite épizootique • Métrite contagieuse équine • Morve • Piroplasmose équine • Rhinopneumonie équine • Surra (Trypanosoma evansi) • Variole équine

Maladies des suidés

• Brucellose porcine • Cysticercose porcine • Encéphalomyélite à entérovirus • Gastro-entérite transmissible • Rhinite atrophique du porc • Syndrome dysgénésique et respiratoire du Porc

Maladies des lagomorphes

• Maladie hémorragique du lapin • Myxomatose • Tularémie

Maladies des oiseaux • Bronchite infectieuse aviaire • Bursite infectieuse (Maladie de Gumboro) • Chlamydiose aviaire • Choléra aviaire • Entérite virale du canard • Hépatite virale du canard • Laryngotrachéite infectieuse aviaire • Maladie de Marek • Mycoplasmose aviaire (M. gallisepticum) • Pullorose • Tuberculose aviaire • Typhose aviaire • Variole aviaire

Maladies des abeilles • Acariose des abeilles • Loque américaine • Loque européenne • Nosémose des abeilles • Varroase

Maladies des poissons

• Herpèsvirose du saumon masou • Nécrose hématopoïétique épizootique • Nécrose hématopoïétique infectieuse • Septicémie hémorragique virale • Virémie printanière de la carpe

Maladies des mollusques • Bonamiose (Bonamia ostreae, B. exitiosus,

Mikrocytos roughleyi) • Maladie MSX (Haplosporidium nelsoni) • Marteiliose (Marteilia refringens, M.

sydneyi) • Mikrocytose (Mikrocytos mackini) • Perkinsose (Perkinsus marinus, P. olseni/

atlanticus)

Maladies des crustacés • Maladie de la tête jaune • Maladie des points blancs

Autres maladies de la liste B Leishmaniose

158

Annexe 5: culture en tube « bijou » (ou en shell-vial) (65)

La technique de culture en shell-vial (ou tube bijou) est une technique de culture et d'isolement des bactéries intracellulaires strictes et facultatives. C'est une technique mise au point pour l'isolement de cytomégalovirus, qui a par la suite été adaptée à l'isolement de bactéries intracellulaires dans l'Unité des Rickettsies. Cette technique comprend toujours une centrifugation pratiquée immédiatement après l'inoculation, cette centrifugation améliorant la sensibilité de la technique. En revanche il est possible, en fonction du microorganisme recherché, de faire varier le type cellulaire à inoculer, la température et la durée d'incubation, ainsi que le mode de révélation des cultures. Le shell-vial est un petit tube en polycarbonate de 1 cm de diamètre et 3 cm de haut avec un bouchon à vis. Au fond du tube se trouve une lamelle (verre ou plastique) sur laquelle a été cultivé un tapis cellulaire. Pour assurer la survie des cellules, le tube shell-vial contient 1 mL de milieu de culture cellulaire. En cas d'incubation prolongée, le milieu peut être changé sans que l'on ait à toucher au tapis cellulaire.

Principe de la technique Le prélèvement supposé infecté est inoculé dans le shell-vial dont le milieu pour culture cellulaire a été retiré. Après une centrifugation de 30 minutes, le liquide est retiré et 1 mL de milieu de culture cellulaire est ajouté. Le shell-vial est ensuite incubé en étuve à une température adaptée au type cellulaire utilisé et au microorganisme recherché. Technique de mise en évidence Coloration : les bactéries peuvent être colorées dans le surnageant ou en grattant quelques cellules qui sont fixées sur une lame après cytocentrifugation. La coloration la plus communément utilisée est la coloration de Gimenez qui colore bien toutes les bactéries intracellulaires, mais il est possible de réaliser une coloration de Ziehl ou de Gram. Immunofluorescence : à condition de posséder un anticorps fluorescent poly- ou monoclonal contre le microorganisme recherché, il est possible de réaliser une détection des bactéries par immunofluorescence. Dans ce cas il est possible de réaliser l'immunofluorescence directement dans le tube. A la fin de la coloration, la lamelle de verre qui supporte la monocouche cellulaire est montée en glycérine puis examinée au microscope à fluorescence. Biologie moléculaire : il est aussi possible de détecter l'ADN des bactéries que l'on recherche à partir du surnageant de culture ou de quelques cellules grattées dans le fond du tube. Ces derniers sont traités avec un système d'extraction d'ADN, puis une PCR est réalisée. Les prélèvements que l'on peut ensemencer sur shell-vial Biopsies, valves, pus, aspiration et liquides divers: les prélèvements doivent être placés dans un tube sec stérile puis transportés rapidement au laboratoire. Si un transport rapide est impossible, une congélation à -80°C est préférable. Le prélèvement doit être facile à ensemencer, c'est à dire qu'en présence de morceaux de tissus, il sera nécessaire de dilacérer avec un scalpel, puis éventuellement de reprendre l'ensemble avec quelques gouttes de milieu de culture cellulaire avec des billes.

159

Sang : pour le sang, c'est la couche leucocytaire qui est ensemencée. En pratique, le sang est prélevé sur tube hépariné. Le tube est mis à décanter en position verticale pendant 30 à 60 minutes. Les leucocytes et les cellules endothéliales sont localisés dans le millilitre de sang placé au dessus des globules rouges. Si un transport rapide est impossible, une congélation de la couche leucocytaire à -80°C est préférable. Ectoparasites : tous les ectoparasites broyés sont inoculables en shell-vial à condition de désinfecter préalablement leur surface avec de l'alcool. Pour les tiques il est possible de n'ensemencer que l'hémolymphe en coupant l'extrémité d'une patte. Urines : en pratique, leur utilisation est limitée à la recherche de Chlamydia trachomatis. Il est nécessaire avant ensemencement de tamponner les urines trop acides avec un peu de soude.

Espèces bactériennes que l’on peut isoler en shell-vial. Incubation Espèce Cellules Température Durée

Rickettsia groupe typhus HEL, MRC-5, Vero 35°C 7-21 jours

Rickettsia groupe boutonneux HEL, MRC-5, Vero 37°C 7-21 jours

Rickettsia pulicis XTC-2 28°C 21 jours Coxiella burnetii HEL, Vero, MDCK 37°C 21 jours Bartonella sp ECV-34 37°C 45 jours Chlamydia trachomatis Mc Coy 37°C 7 jours

Mycobacterium tuberculosis ECV-34 37°C 45 jours

Francisella tularensis HEL 37°C 21 jours Tropheryma whipplei HEL 37°C 3-6 mois

160

Annexe 6: la tenue de combat NBC à port permanent CE/OM (52).

L’ensemble veste et pantalon est constitué de deux couches : - une couche extérieure de tissu croisé coton/polyester (190 g/m2), hydrofuge (bonne tenue à l’eau) et oléofuge (bonne tenue aux graisses et aux hydrocarbures) possédant une bonne résistance mécanique et une bonne résistance à la lumière. - une couche intérieure anti-vapeur d’1mm d’épaisseur en mousse comprimée de polyuréthane imprégnée de charbon actif contrecollée sur l’une de ses faces par un tissu jersey soit polyamide (265 g/m2) soit coton (290 g/m2). L’épaisseur totale des deux couches est de 1, 8 mm pour une masse de 480 g/m2. Les sous-gants et les chaussettes sont en mousse carbonée.

161

Annexe 7: la tenue légère de décontamination modèle 93 (52).

Elle est destinée à la protection du personnel effectuant des opérations de décontamination. Elle offre une résistance aux toxiques supérieure à 24 heures et se décontamine facilement. Coût : 83 €.

162

Annexe 8: recommandations relatives à la diffusion intentionnelle de Coxiella burnetii (plan Biotox) (10).

Signaux d’alarme pouvant indiquer une propagation intentionnelle de Coxiella burnetii par aérosol : Si sur une période d’une ou deux semaines, un nombre relativement important de personnes développent un syndrome fébrile non spécifique qui, dans environ un cas sur quatre, est associé à des symptômes pulmonaires, il faut tenir compte de la possibilité d’une propagation intentionnelle de Coxiella burnetii. Propagation intentionnelle : Il est très vraisemblable que la propagation se fasse sous la forme d’un nuage de spores

de Coxiella burnetii qui seraient inhalées par les personnes attaquées. L’organisme est facilement propagé par aérosol, est très stable et très résistant à la chaleur et à la déshydratation. Le potentiel de Coxiella burnetii en tant qu’arme biologique est directement lié à la forte

contagiosité de la bactérie. On évalue que 50 kg de Coxiella burnetii sous la forme de poudre séchée pourraient

causer autant de victimes qu’une quantité identique d’anthrax ou d’organismes propageant la tularémie. Prélèvements à réaliser : Echantillons: 5-10 mL de sang au début de la maladie et après deux à trois semaines. Conteneurs : dans un petit tube de sérum solidifié. Refroidir après prélèvement et transporter aussi rapidement que possible sur de la glace. Prendre des précautions pour éviter la contamination externe : mettre l’échantillon dans un sachet en plastique scellé avec la mention « risques élevés ». Mettre le sachet en plastique dans un deuxième emballage, prévoir un matériau absorbant de façon à éviter les fuites éventuelles. Désinfecter l’emballage extérieur, par exemple de l’hypochlorite à 0.1%. Mettre l’ensemble dans un troisième emballage. Attention ! Chaque échantillon doit être emballé séparément. Voir référence “UN 602 standard packaging”. Diagnostic post mortem : Dans les rares cas de décès, on peut constater une pneumonie ou une endocardite. L’agent de la fièvre Q peut être identifié dans les tissus (foie ou valvule) par immunocoloration ou microscopie électronique. Diagnostic différentiel : Etant donné que la fièvre Q se manifeste en général comme une maladie non différenciée ou comme une pneumonie atypique primaire, il est difficile de la distinguer des pneumonies virales et des maladies provoquées par Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydia psittaci et Chlamydia pneumoniae. Des formes de pneumonie due à la fièvre Q qui connaissent une progression plus rapide peuvent ressembler à des pneumonies bactériennes provoquées par la tularémie ou la peste. Les hépatites granulomateuses aiguë et chronique doivent être distinguées de l’hépatite tuberculeuse.

163

Définition de cas : Cas suspect : Une personne précédemment saine qui présente une image clinique qui correspond à la fièvre Q aiguë. Cas confirmé : Un cas de fièvre Q confirmé en laboratoire ou une image clinique de fièvre Q chez des personnes qui ont éventuellement été exposées à un même aérosol de spores. Interventions sanitaires : 1. Traitement médical d’un patient atteint de fièvre Q La plupart des patients se rétablissent totalement sans traitement après quelques mois.

Toutefois, les antibiotiques écourteront la durée de la maladie. La doxycycline est le meilleur traitement en cas de fièvre Q aiguë. La thérapie aux antibiotiques est la plus efficace lorsqu’elle est entamée durant les trois premiers jours de la maladie. La meilleure thérapie pour la fièvre Q aiguë est la doxycycline 100 mg deux fois par jour

jusqu’à ce que le patient n’ait plus de fièvre pendant deux jours. Le traitement doit être répété en cas de rechute. Les quinolones présentent une bonne activité in vitro contre Coxiella burnetii et constituent une bonne alternative. Il n’est pas nécessaire d’isoler le patient. L’endocardite chronique due à la fièvre Q est plus difficile à traiter et requiert souvent

l’utilisation de différents médicaments. On teste encore deux protocoles de traitement différents : (a) doxycycline combinée avec des quinolones pour au moins 4 années et (b) doxycycline combinée avec l’hydroxycholoroquine pour 18 à 36 mois. Ce dernier schéma provoque moins de rechutes, mais nécessite des examens réguliers des yeux. Prophylaxie : Il n’y a pas de vaccin disponible dans le commerce. 2. Mesures en cas de signalement d’un premier cas d’inhalation ayant provoqué la fièvre Q Traitement du patient : voir traitement médical. Mesures de précaution pour le personnel hospitalier : Se laver les mains, appliquer les mesures de précaution standard durant les soins au

patient. Désinfection des expectorations, du sang et du matériel souillé par ces substances, avec

une solution contenant 0.05% d’hypochlorite, 1:100 de Lysol ou 5% de peroxyde. Lancer aussi rapidement que possible une enquête épidémiologique pour déterminer la source et l’étendue (zone d’exposition) de l’infection. Mesures pour les contacts avec les patients : La vaccination n’est pas nécessaire pour les contacts. Observation des personnes exposées et antibiothérapie pour celles qui deviennent

malades. Chercher une éventuelle source commune d’exposition : o Pour une transmission de manière non naturelle : utilisation de lait non pasteurisé, contact avec des moutons, des chèvres ou des bovins dans les exploitations agricoles ou les établissements de recherche, contact avec un laboratoire où l’on manie Coxiella burnetii. o En cas de soupçon d’une propagation intentionnelle de Coxiella burnetii : vérifier s’il y a eu une contamination collective, par le dépistage actif des contacts et la détermination de l’étendue de la zone d’exposition (interrogation systématique de tous les patients). Mesure administratives et de sécurité Signaler immédiatement chaque cas confirmé aux autorités sanitaires.

164

Prélever des échantillons de tous les matériaux possibles : poussière, vêtements, etc. se trouvant là où a eu lieu une contamination prouvée par Coxiella burnetii. Décontamination de l’endroit où il y a eu propagation de Coxiella burnetii

(aérosolisation) au moyen d’une solution de 0.05% d’hypochlorite, de 1:100 de Lysol. 3. Mesures à prendre en cas de propagation intentionnelle de Coxiella burnetii (sous forme d’aérosol) Pour le patient : voir traitement médical. Mesures de précaution pour le personnel hospitalier : Se laver les mains, appliquer les mesures de précaution standard durant les soins au

patient. Antibiothérapie pour les personnes qui commencent à présenter des symptômes de la

maladie. Mesures de précaution pour le personnel d’intervention (police, protection civile) : Dans le cas où l’on soupçonne une propagation à grande échelle de spores sous la forme

d’aérosol, il convient de placer l’ensemble du personnel d’intervention essentielle sous observation régulière et de lui administrer des antibiotiques dès que des symptômes se manifestent. Pour les contacts:

• La vaccination n’est pas nécessaire pour les contacts. • Observation des personnes exposées et antibiothérapie pour celles qui deviennent malades. Mesures administratives et de sécurité : Signaler immédiatement chaque cas suspect aux autorités sanitaires. Déterminer l’étendue de la zone d’exposition et décontamination de la zone.

Laboratoire de référence : Encore inconnu – vraisemblablement Robert Koch Institut à Berlin. Epidémiologistes de référence : Institut scientifique Santé publique Département épidémiologie Tel 02/ 642 5037 of 0479 / 45 95 49 [email protected] Clinicien de référence : Professeur Renaat Peleman, Maladies infectieuses, RUG Gent. Documents de référence : - Byrne WR. Q Fever. Textbook of Military Medicine: Medical aspects of chemical and biological warfare. Borden Institute Water Reed Army Medical center, Office of the Surgeon general united States Army, United States Army Medical Department Center and School et al. 1997; 524-537. - Health Canada. Fiche technique, Santé-Sécurité. Matières infectieuses. Coxiella burnetii. USAMRIID’s Medical Management of Biological Casualties Handbook. Fourth Edition, February 2001. US Army Medical research Institute of Infectious Diseases Fort Detrick Frederick, Maryland. - Benenson A.S. Q Fever. Control of communicable diseases Manual. 16th edition, 1995. Q fever. http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/qfever/ - Peter O et al. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and complement fixation and indirect fluorescent-antibody tests for detection of Coxiella burnetii antibody. J Clin Microbiol 1987 ; 25 :1063-1067. - The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Section 13.Infectious Diseases. Chapter 159. Rickettsial Diseases.

165

Annexe 9: technique utilisée pour la production des deux souches de Coxiella burnetii phase I (70, 109).

- inoculation de 108 Coxiella burnetii en phase II (souches Nine Mile et Q212) à des souris

Balb/c par voie intrapéritonéale. - stabulation des souris en laboratoire L3 pendant trois semaines. - sacrifice et prélèvement de la rate. - broyage de la rate dans du milieu MEM. - inoculation du broyat à des cellules L929 (fibroblastes de souris) préalablement cultivées

dans du milieu MEM (Minimal Essential Medium) pendant 48 heures de façon à obtenir un tapis homogène.

- incubation des boîtes inoculées pendant une heure à température ambiante de façon à ce que les bactéries infectent les cellules.

- ajout de glutamine à 2 mmol/L et de sérum de veau fœtal à 4%. - incubation à 35°C pendant huit à neuf jours.

On contrôle alors la multiplication bactérienne en réalisant un frottis ainsi qu’une coloration de Gimenez (annexe 1). On réalise ensuite un second passage (à partir d’une boîte, on inocule six nouvelles boîtes de cellules) de façon à parfaire la sélection des bactéries de phase I car, au terme du premier passage, il reste environ 10% de bactéries en phase II.

- centrifugation de la suspension cellulaire à 7 500 rpm pendant 10 min à +4°C. - mise en suspension du culot dans du PBS. - sonication à 60 W pendant trois fois une minute (destruction des membranes cellulaires

eucaryotes). - centrifugation à 10 000 rpm pendant dix minutes à +4°C. - récupération du surnageant, filtration sur coussin de sucrose (solution de saccharose à

25%) et centrifugation à 10 000 rpm pendant dix minutes à +4°C (étape de purification à réaliser deux ou trois fois).

- récupération du surnageant et centrifugation à 7 500 rpm pendant 30 min à +4°C. - récupération du culot et lavage dans du PBS. - contrôle : par immunofluorescence, on vérifie la sélection des bactéries de phase I et l’on

détermine le titre de l’inoculum (méthode similaire à la méthode utilisée pour l’analyse sérologique (annexe 12)).

166

Annexe 10: effet du temps d’exposition à l’aérosol (Mycobacterium smegmatis) sur la charge bactérienne pulmonaire

à J0 (74).

4

4,1

4,2

4,3

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

0 20 40 60 80 100 120 140 160

temps d'exposition (min)

char

ge b

acté

rien

ne p

ulm

onai

re(lo

g U

FC/m

L)

Annexe 11: relation entre la taille de l’inoculum (Mycobacterium smegmatis) et la charge bactérienne pulmonaire à J0 (74).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9

taille de l'inoculum (log UFC/mL)

char

ge b

acté

rien

ne p

ulm

onai

re (l

og U

FC/p

oum

on)

167

Annexe 12: technique d’analyse sérologique mise en œuvre (immunofluorescence indirecte semi-quantitative) (58, 70, 122).

- dépôt à la plume de Coxiella burnetii phase I et II préalablement inactivées au formol 0,1% sur la moitié d’un spot d’une lame de verre 18 spots Dynatech®.

- fixation des bactéries dans un bain de méthanol (5 min). - mélange de 16 µL de sang total (prélevé sur EDTA) dans 200 µL de PBS-lait (3 g de

lait en poudre dans 100 mL de PBS). La dilution ainsi obtenue équivaut à une dilution au 1/25 lorsqu’on travaille sur du sérum.

- dilutions en cascade d’un facteur 2 jusqu’au 1/3 200. - dépôt de 30 µL de chaque dilution sur chaque spot de la lame. - incubation en atmosphère humide pendant 30 min à 37°C. - rinçage : 10 min dans deux bains distincts de PBS Tween. 5 min dans l’eau distillée. - essuyage et séchage à l’étuve. - dépôt sur chaque puits de 30 µL d’une solution d’anticorps de chèvre conjugué à de la

fluorescéine (Beckman Coulter, Villepinte, France) et dirigé contre les immunoglobulines de souris. Cette solution est diluée au 1/100 dans du PBS-lait. On ajoute une goutte de bleu Evans comme contre-coloration.

- incubation en atmosphère humide pendant 30 min à 37°C. - rinçage : 10 min dans deux bains distincts de PBS Tween. 5 min dans l’eau distillée. - essuyage et séchage à l’étuve. - montage des lames avec du Fluoprep® (milieu de montage pour immunofluorescence). - lecture au microscope à fluorescence.

Fluorescence positive (grossissement x100). Fluorescence négative (grossissement x100).

168

Annexe 13: technique d’immunohistochimie (kits Histostain-Plus®, Rabbit primary (AEC) (Zymed Laboratories Inc., CliniSciences, Montrouge, France)) (70, 71, 72).

- les lames d’histologies sont déparaffinées dans deux bains successifs de xylène

(microclearing®) pendant 5 min. - les coupes tissulaires sont réhydratées dans des bains successifs de :

¤ éthanol 100%, 5min. ¤ éthanol 95%, 5min. ¤ eau courante, 5 min.

- les péroxydases sont inhibées par un bain d’eau oxygénée 0,3% pendant 10 min.

- rinçage par aspersion de PBS (150 mmol/L).

- application du sérum bloquant (PBS-BSA azide) sur la coupe tissulaire pendant 10 min. Le PBS-BSA permet de saturer les sites antigéniques non spécifiques, l’azide permet la conservation du produit en inhibant la croissance bactérienne.

- égoutter les lames. - application de 100 à 200 µL d’anticorps anti-Coxiella burnetii polyclonal dilué au

1/2000 (anticorps de lapin) dans du PBS-BSA azide 3% pendant 30 min. - rinçage au PBS. - application de l’anticorps secondaire (anticorps anti-lapin) lié à la

biotine pendant 10 min. - rinçage au PBS. - application de la streptavidine liée à la péroxydase pendant 10 min.

- rinçage au PBS.

- application du chromogène (Amino Ethyl Carbazole (AEC)) pendant 10 min. - égoutter puis rinçage à l’eau courante pendant 2 min. - contre-coloration par un bain d’hématoxyline de Mayer pendant 2 min. - rinçage à l’eau courante. - bleuir les lames à l’eau ammoniaquée 0,5% et rinçage à l’eau distillée. - fixation au glycérol et montage de la lamelle. - lecture au microscope optique.

169

Annexe 14: technique d’extraction de l’ADN (QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN S.A.,

Courtaboeuf, France)). Etape de digestion pour les prélèvements tissulaires :

- broyer 25mg de tissu dans 180µL d’ATL (tampon de lyse tissulaire). - ajouter 20µL de protéinase K à 25 mg/mL. - incuber au bain marie à 56°C jusqu’à ce que la digestion

soit complète. Extraction proprement dite (l’extraction commence directement à cette étape pour 200 µL de prélèvement liquide et 20 µL de protéinase K) :

- ajouter 200µL d’AL (tampon de lyse cellulaire contenant de l’hydrochlorure de guanidine) et homogénéiser pendant 15 s.

- incuber à 70°C pendant 10 min et centrifuger brièvement (short spin). - ajouter 200µL d’éthanol 100% et homogénéiser pendant 15 s. - transférer le mélange dans les colonnes d’extraction

(QIAamp® Spin Columns fournies dans le kit). - centrifuger à 10 000 tours/min pendant 1 min. - ajouter 500µL d’AW1 (premier tampon de lavage)

et centrifuger à 10 000 tours/min pendant 1 min. - ajouter 500µL d’AW2 (deuxième tampon de lavage) et centrifuger

à 13 000 tours/min pendant 3 min.

- ajouter 100µL d’AE (tampon d’élution), incuber 1 min à température ambiante et centrifuger à 10 000 tours/min pendant 1 min. On récupère ainsi l’ADN extrait dans le tampon d’élution.

170

Annexe 15: séquence des amorces Sod 1 et 2 et des fragments qu’elles amplifient (11).

Amorces utilisées : Sod 1F : 5’CGA-ATA-TCA-CCA-CGG-AAA-AC 3’ Sod 1R : 5’C-GTT-AAA-GAT-AAC-AAT-GGC-AAA 3’

Fragment externe amplifié par Sod 1 (286 pb) : 5’CGA-ATA-TCA-CCA-CGG-AAA-ACC-ATA-GAG-CTT-ATG-TCA-ATA-AAC-TCA-ACA-AAC-TTA-TCG-AAG-GCA-CCC-CTT-TTG-AAA-AGG-AAC- CTC-TGG-AAG-AAA-TTA-TTC-GAA-AAT-CCG-ACG-GCG-GAA-TCT-TCA-ACA-ATG-CAG-CAC-AAC-ATT-GGA-ACC-ATA-CAT-TTT-ATT-GGC-ACT-GCA-TGA-GCC-CTG-ATG-GCG-GTG-GAG-ATC-CTT-CTG-GCG-AAT-TGG-CTT-CAG-CTA-TTG-ATA-AAA-CTT-TTG-GAT-CTT-TAG-AGA-AAT-TTA-AAG-CGC-TTT-TTA-CCG-ACT-CCG-CAA-ATA-ATC-ATT-TCG-GCT-CGG-GAT-GGG-CTT-GGC-TCG-TTA-AAG-ATA-ACA-ATG-GCA-AA 3’ Sod 2F : 5’C-CTC-TGG-AAG-AAA-TTA-TTC 3’ Sod 2R : 5’T-TGG-CTT-CAG-CTA-TTG-ATA 3’ Fragment interne amplifié par Sod 2 (104 pb) : 5’GAA-AAT-CCG-ACG-GCG-GAA-TCT-TCA-ACA-ATG-CAG-CAC-AAC-ATT-GGA-ACC-ATA-CAT-TTT-ATT-GGC-ACT-GCA-TGA-GCC-CTG-ATG-GCG-GTG-GAG-ATC-CTT-CTG-GCG-AA 3’

171

Annexe 16: réactifs utilisés pour la réaction de nested PCR (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I®, Roche Diagnostics, Meylan, France) (136).

- mélange de 10 µL de 1a (Taq polymérase « Hot Start » (72°C)) dans un tube de 1b (dNTP et fluorochrome SYBR Green® dans du MgCl2 à 10 mmol/L).

- mettre dans chaque capillaire :

¤ 4 µL du mélange 1a + 1b. ¤ 4,8 µL de MgCl2 à 25 mmol/L (tube 2). ¤ 3,2 µL d’eau (tube 3). ¤ 2 µL de BSA : ce tampon permet de protéger la Taq polymérase d’éventuelles dégradations par des enzymes résiduelles. ¤ 1 µL de chaque amorce régénérée à 1 nmol/µL et diluée au 1/100.

Annexe 17: préparation des gels d’agarose à 2% et dépôt des échantillons (123).

- mettre 2 g d’agarose en poudre dans 100 mL de TBE à 0,5 volume. - dissoudre au micro-ondes à 800W pendant 2 à 4 min. - mélanger 50 mL du mélange précédant à 17 µL de BET dilué au 1/20. - couler le gel dans un support muni de peignes et laisser refroidir 5 à 10 min. - placer le gel dans la cuve à migration remplie de TBE à 0,5 volume. - déposer, dans un puit du gel, 5 µL de chaque échantillon mélangé à une goutte de

bleu de charge. - déposer 2,8 µL de marqueur de poids moléculaire dans les puits aux extrémités du

gel. - faire migrer pendant 30 min à 135V.

172

Annexe 18: effets cytopathiques des souches Nine Mile et Q212 (119, 124).

Effet cytopathique de la souche Nine Mile : les cellules infectées (fibroblastes L929) sont de

petite taille, ainsi que le phagolysosome contenant Coxiella burnetii.

Effet cytopathique de la souche Q212 : les cellules infectées (fibroblastes L929) sont de grande taille, le phagolysosome contenant Coxiella burnetii est très volumineux et occupe tout le cytoplasme.

MAGISSON-RICCI Fanny : Etude expérimentale de la transmission par aérosols de l’agent de la fièvre Q (Coxiella burnetii) sur modèle murin. Thèse Vétérinaire : Lyon, le 06 octobre 2003

RESUME :

Décrite depuis 1935, la fièvre Q est une zoonose répandue dans le monde entier. Cependant, elle demeure mal connue alors que le danger inhérent à son agent causal, Coxiella burnetii, est, pour l’Homme, grave voire mortel, son diagnostic étant difficile, son traitement contraignant et les moyens prophylactiques limités.

De plus, Coxiella burnetii fait partie des agents biologiques utilisables dans le cadre du risque biologique provoqué intentionnel, sujet qui préoccupe les Etats de façon accrue depuis les récents évènements bioterroristes.

Ainsi, notre étude tente d’apporter des réponses à la question suivante : quelle est la nature réelle, en terme de danger et de risque, de cette double menace ? Pour cela, nous avons étudié cette zoonose à la fois dans le cadre de l’infection naturelle et dans celui du risque provoqué afin d’élaborer un modèle expérimental murin d’infection par aérosols reproduisant au mieux les effets biologiques d’une diffusion, intentionnelle ou non, de Coxiella burnetii. MOTS CLES :

- Fièvre Q - Coxiella burnetii - Zoonose - Aérosols - Bioterrorisme

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Fabry

1er Assesseur : Monsieur le Professeur Prave 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Chantegrelet Membres invités : Monsieur le Vétérinaire Biologiste en Chef Davoust

Monsieur le Vétérinaire Biologiste en Chef Baylac DATE DE SOUTENANCE :

06 octobre 2003

ADRESSE DE L’AUTEUR : 5, rue du Chapeau Rouge 69 009 LYON